Ионные каналы растений

Впервые наличие ионных каналов предсказали в 1952 г. английские физиологи А. Ходжкин (A. L. Hodgkin) и А. Хаксли (A. F. Huxley) на основе математического анализа ионных потоков К⁺ и Na⁺, возникающих в ходе проведения нервного импульса. Они предположили, что ионные токи идут только через определенные участки мембраны, так называемые active patches. Позднее в этих участках действительно были обнаружены потенциалзависимые Na- и К-каналы.

Ионные каналы формируются интегральными белками, которые пронизывают мем­брану таким образом, что в ней образуется гидрофильная пора. При этом гидрофильные аминокислоты выстилают стенки поры, а гидрофобные — контактируют с липидной фазой мембраны. Движение ионов через эту внутримембранную гидрофильную пору происходит в один ряд по так называемому эстафетному механизму.

Модель ионного канала

В отличие от облегченной диффузии, транспорт ионов через каналы представляет со­бой процесс, который идет без насыщения и с более высокой скоростью. Особенностью транспорта иЬнов через каналы является также их односторонняя проницаемость.

Ионные каналы классифицируются по принципу управления воротным механизмом и по селективности к различным ионам. Каналы способны избирательно открываться (или закрываться) при изменении мембранного потенциала, а также при гормональных, механических, осмотических и других воздействиях.

В зависимости от способа взаимодействия между воротным механизмом и сенсором внешнего сигнала ионные каналы делят на две группы. Первую группу образуют такие каналы, у которых сенсор внешнего сигнала входит в состав молекулы канала непосредственно. Эта группа включает потендиалзависимые ионные каналы, которые реагируют на изменение мембранного потенциала, а также лигандуправляемые каналы, открываемые при связывании с рецептором специфических агонистов. У каналов второй группы сенсор внешних стимулов пространственно отделен от канала. В этом случае внешний сигнал от сенсора на канал передается через систему внутриклеточных посредников. Эта группа включает рецептороуправляемые каналы и каналы, управляемые G-белками.

Кинетические свойства конкретного ионного канала определяются его проницаемостью, селективностью и функционированием воротного механизма. Большинство ионных каналов находится в открытом состоянии лишь очень короткое время. Переход канала в открытое состояние осуществляется с помощью воротного механизма (ворот), который обычно расположен в его устье. Открывание и закрывание воротного механизма является результатом конформационных изменений белка. При открывании ионного канала регистрируется резкое возрастание электрического тока через мембрану. Открывание и закрывание ионных каналов регулируется мембранным потенциалом, ионами Са²⁺, рН, фосфорилированием, жирными кислотами и G-белками. В случае потенциалеависимых каналов открывание ворот происходит при изменении мембранного потенциала. Каналы, ассоциированные с рецепторами, открываются в ответ на структурные изменения рецептора.

Селективность ионного канала обусловливается диаметром просвета канала, природой и распределением заряженных групп, особенно тех, которые локализованы непосредственно у входа в канал, где они выполняют функцию селективного фильтра. Последний включает в себя кольцо кислородных атомов, способное осуществлять дегидратацию ионов. Селективные свойства канала определяются последовательностью аминокислот, входящих в состав фильтра.

Проницаемость единичного канала составляет несколько сотен ионов в секунду, что на три порядка быстрее, чем транспорт, катализируемый помпами и переносчиками, и на 11 порядков выше, чем простая диффузия ионов через мембрану. Отличительной особенностью ионных каналов является то, что в открытом состоянии они обеспечивают относительно постоянный поток ионов в одном направлении при конкретной величине мембранного потенциала и в определенной ионной среде. В процессе транспорта через канал происходит взаимодействие иона с белком, поэтому передвижение ионов по каналам отличается от транспорта через аквапорины, в которых эти взаимодействия минимальны. Проводимость канала зависит от заполнения ионами участков на входе и выходе. Выход иона из канала облегчается при появлении на входе другого иона из-за их электростатического отталкивания. Однако при высоких концентрациях электролита может происходить насыщение проводимости канала из-за заполнения ионами его входа и выхода и, как следствие, блокировка канала. Передвижение иона через пору канала сопряжено с преодолением энергетического барьера, величина которого зависит от диаметра поры, энергии гидратации иона, величины рН, ионной силы и других условий, способных понижать энергию активации при прохождении селективного фильтра. Ионы перемещаются по каналу не путем простой диффузии, а в результате последовательных стадий дегидратации и связывания со стенками поры канала. При этом происходит замещение молекул воды гидратной оболочки иона на полярные группы в полости канала. Поскольку увеличение свободной энергии иона при дегидратации с избытком компенсируется энергией его взаимодействия с полярными группами канала, общая энергия иона снижается, что облегчает его прохождение через канал. Наличие в центре канала полярных групп и фиксированных отрицательных зарядов также способствует снижению энергетического барьера для перехода катионов из раствора в канал. Основными параметрами, которые применяют для оценки типа и физиологической роли канала, являются селективность, принципы регуляции воротного механизма, проницаемость и его фармакологические характеристики. В растениях обнаружены практически все основные типы ионных каналов, известные у животных организмов.

К⁺-каналы. Большинство К⁺-каналов блокируются четвертичными соединениями аммония (в частности, тетраэтиламмонием) и имеют сходную селективность и хорошую проницаемость только для четырех катионов (Tl⁺, К⁺, Rb⁺, NH4 ). При снижении рН проводимость К⁺-каналов резко падает из-за протонирования аминокислотных групп в поре канала. У растительных организмов найдены потенциалзависимые и Са-зависи- мые К⁺-каналы. Потенциалзависимые К⁺-каналы могут активироваться как при деполяризации мембраны, например К⁺-каналы выходящего выпрямления (outward-rectifying), так и при ее гиперполяризации — К⁺-каналы входящего выпрямления (inward-rectifying). Функционирование потенциалзависимых К⁺-каналов определяет содержание калия в цитоплазме, тургор клетки, фазу реполяризации в ходе генерации потенциала действия ; и некоторые другие функции. К⁺ -каналы выходящего выпрямления (Кaut-каналы), активирующиеся при деполя- ! ризации мембраны, обнаружены в плазмалемме водорослей, клеток высших растений и дрожжей. Они участвуют в движении устьиц и обеспечивают поток калия из клетки I в ходе генерации потенциала действия у харовых водорослей и высших растений. К⁺ -каналы входящего выпрямления (Кin-каналы), которые активируются при уве­личении мембранного потенциала, имеют более высокую селективность по отношению к ионам К⁺. Полупериод активации К+-каналов растений в ответ на гиперполяриза­цию плазмалеммы лежит в пределах 25-200 мс. Каналы могут оставаться в открытом состоянии несколько минут и обеспечивать, в отличие от К⁺-каналов животных, до­статочно продолжительный поток калия в клетку. Растительные К⁺-каналы содержат шесть трансмембранных доменов (рис. 5.11). Один из доменов выступает в качестве сенсора мембранного потенциала (S4), другие участки формируют гидрофильную пору в устье канала (Р), выявлены также места связывания с циклическими нуклеотидами и белками цитоскелета (анкиринами). Предполагается, что К+-каналы обеспечивают поглощение калия клетками расте­ний при содержании его в среде около 1 мМ. Известно, что содержание ионов К⁺ в цитоплазме растительных клеток колеблется от 60 до 150 мМ. Возможность транспор­та калия в клетку по К⁺-каналам против градиента концентрации достигается за счет того, что функционирующая в плазмалемме Н⁺-помпа генерирует отрицательный мем­бранный потенциал, составляющий от -120 до -220 мВ. Этот потенциал и позволяет аккумулировать калий клетками через К⁺-каналы даже при 100-кратном градиенте концентрации. Небольшое количество таких каналов в мембране может обеспечивать значительный поток калия в клетку, так как скорость транспорта — более 100 ионов в секунду. Такой тип мембранного транспорта калия, вероятно, встречается только у расте­ний и имеет очень важное значение для минерального питания, поскольку содержание ионов К⁺ в почвенном растворе и фазе клеточной стенки различных тканей обычно варьирует от 0,3 до 15 мМ . Следует отметить, что селективный фильтр некоторых К^- каналов может также пропускать ионы NHJ и некоторые другие катионы. Работа К^- каналов высших растений эффективно модулируется фитогормонами (АБК) и такими вторичными посредниками, как ионы Са²⁺, инозитолтрисфосфат, диацилглицерол, G- белки. Ионы Cs⁺, Na⁺, Са²⁺ и А1³⁺ снаружи клетки подавляют функционирование Ку­кана лов. В отличие от животных, К^-каналы растительных организмов практически не зависят от концентрации ионов Mg²⁺ в цитоплазме. Са²⁺ -активируемые К⁺-каналы начинают функционировать при увеличении содер­жания ионизированного кальция в цитоплазме, поскольку рецептор для ионов Са²⁺ расположен на внутренней стороне мембраны. Сродство этого рецептора к ионам Са²⁺ зависит от мембранного потенциала и обычно возрастает при деполяризации мембраны. Поэтому работа Са²⁺-активируемых К⁺-каналов зависит и от концентрации кальция, и от величины мембранного потенциала. При деполяризации мембраны содержание кальция в цитоплазме возрастает в результате двух процессов: входа снаружи по по- тенциалзависимым Са²⁺-каналам и мобилизации из различных внутриклеточных депо (эндоплазматический ретикулум, вакуоль). Взаимодействие ионов Са²⁺ с рецептором Са²⁺-зависимых К⁺-каналов переводит их в открытое состояние, и ионы калия начи­нают выходить из клетки по градиенту электрохимического потенциала. Это является причиной гиперполяризации мембранного потенциала и закрытия потенциалзависи- мых Са²⁺-каналов. Концентрация кальция в клетке снижается, и мембранный потен­циал стабилизируется. Таким образом, взаимодействие калиевых и кальциевых каналов позволяет регулировать потенциал покоя клетки.Са²⁺-каналы. Выделяют потенциалзависимые, рецептороуправляемые и механо- чувствительные Са-каналы (см. рис. 5.2, 5.7). Потенциалзависимые каналы открывают­ся при изменении мембранного потенциала. Активность рецептороуправляемых кана­лов изменяется при взаимодействии некоего гормона (или лиганда) со специфическим рецептором (см. рйс. 5.10).Наиболее распространены потенциалзависимые Са-каналы L-muna (Long-lasting, т. е. долгоживущие), которые, будучи активированы при деполяризации мембраны, со­храняют это состояние относительно долго. Их повторяющиеся открывания обеспечи­вают длительный кальциевый ток через мембрану. Характерным признаком, отлича­ющим Са-каналы L-типа от других, является их чувствительность к дигидропириди- нам, фенилалкиламинам и бензотиазепинам. У потенцйалзависимых Са-каналов сенсор внешнего сигнала является составной частью каналообразующего комплекса.Следует заметить, что деление на потенциалзависимые и рецептороуправляемые каналы достаточно условно, поскольку для многих потенциалзависимых каналов пока­зана прямая регуляция рецепторами. В свою очередь есть данные, свидетельствующие о том, что активность рецептороуправляемых каналов может зависеть от мембранного потенциала. Са-каналы, активируемые при деполяризации мембраны, относительно высокосе­лективны для ионов кальция и демонстрируют низкую проводимость единичного ка­нала. Целый ряд сигналов, включая синий или красный свет, фитогормоны, нодуляци- онные (NOD) факторы и грибные элиситоры, вызывают быструю деполяризацию мем­браны, которая достаточна для открывания Са-каналов. Этот тип Са-каналов имеет важное значение в ответных реакциях растений на внешние воздействия. Они активи­руются, когда мебранный потенциал становится ниже -140 мВ. При этом в качестве эффективного механизма деполяризации часто служит поток анионов из клетки через анионные каналы плазмалеммы.Потенциалзависимые Са-каналы плазмалеммы растительных клеток (в отличие от животных) могут активироваться и при гиперполяризации мембраны. В клетках тома­тов выявлены, например, Са-каналы, которые активируются только при мембранном потенциале выше -120 мВ. При деполяризации мембраны их активность снижалась. Механочувствителъные Са-каналы активируются при механическом натяжении мембраны и при изменении осмотических характеристик цитоплазмы или внешней среды. Каналы такого типа, участвующие в транспорте Са²⁺, были найдены в плазма- лемме и эндоплазматическом ретикулуме растительных клеток. Они отличаются спе­цифичностью по отношению к ионам Са (соотношение токов Са:К составляет у раз­ных объектов от 7:1 до 17:1) и сравнительно невысокой проводимостью одиночного канала.

Рецептороуправляемыми (рецепторооперируемыми) каналами обычно называют каналы плазмалеммы, у которых основные белковые компоненты (ион-переносящая пора, воротный механизм) пространственно отделены от рецептора, который располо­жен в той же мембране. Эти каналы участвуют в повышении концентрации ионов Са²⁺ в цитоплазме при связывании гормонов с их рецепторами на плазматической мембране. От потенциалзависимых Са-каналов они отличаются слабой чувствительностью к ор­ганическим блокаторам. В растительных клетках найдены рецепторооперируемые Са- каналы, активируемые такими гормонами, как АБК и ИУК.

В плазмалемме растительных клеток обнаружены относительно низкоселективные катионные каналы, через которые осуществляется транспорт и К⁺, и Са²⁺. Каналы этого типа характеризуются высокой проводимостью единичного канала и называются макси-катионными (maxi cation channels).

В вакуолярной мембране идентифицировано четыре типа кальциевых каналов. Два из них являются потенциалзависимыми, один из которых активируется при гиперпо­ляризации мембраны, а другой — при ее деполяризации. На тонопласте также обна­ружены Са-каналы, активируемые такими вторичными посредниками, как инозитол- 1,4,5-трисфосфат (IP3) и циклическая ADP-рибоза (cADPR). Фармакологический ана­лиз cADPR-завиеимого Са-канала свидетельствует о его сходстве с рианодиновым рецептором, который наряду с 1Рз-рецептором обеспечивает высвобождение кальция из эндоплазматического ретикулума в процессе сигнализации в клетках; животных организмов.

Анионные каналы. Клетки растительных организмов в обычных условиях харак­теризуются очень высоким электрохимическим градиентом анионов на плазматической мембране. Например, у Chara хлорный диффузионный потенциал (рассчитанный по уравнению Нернста) на плазмалемме, достигает (+300)-(+340) мВ. Поэтому активация анионных каналов, как правило, вызывает резкие изменения мембранного потенциала. Это важная особенность физиологии анионных каналов растений отличает их от анион­ных каналов животных, у которых ионы С1~ близки к состоянию электрохимического равновесия между клеткой и средой. В растениях, по-видимому, только ионы К⁺ на­ходятся в равновесных условиях между цитоплазмой и средой. Для большинства же других ионов (Н+, Са²⁺, Na⁺ и С1~) электрохимические градиенты на плазмалемме и тонопласте далеки от равновесных.

К- факторам, которые индуцируют открывание (или закрывание) анионных кана­лов, относятся их фосфорилирование или дефосфорилирование, изменение концентра­ции ионов Са²⁺ или мембранного потенциала. В плазмалемме и тонопласте харовых водорослей и высших растений имеются анионные каналы, активирующиеся при ги­перполяризации мембраны и повышении содержания ионов Са²⁺ в цитоплазме.

Кальций-зависимые анионные каналы способны усиливать (амплифицировать) по­тенциал действия у харовых водорослей и обеспечивать мощные потоки хлора в про­цессе регулирования тургорного давления и движения устьиц. С1~-каналы плазмалем- мы, активируемые при увеличении содержания ионов Са²⁺ в цитоплазме, обеспечивают фазу деполяризации потенциала действия в растениях. При генерации потенциала дей­ствия у харовых водорослей концентрация ионов Са²⁺ в цитоплазме может достигать 0,6-1,0 мкМ из-за потока кальция снаружи и, возможно, из вакуоли. Это вызывает активацию Са²⁺-зависимых С1~-каналов, локализованных внутри цитоплазмы, и мощ­ный поток ионов С1^_ из клетки.

В плазмалемме клеток высших растений методом петч-кламп (см. с. 159) обнару­жены анионные каналы, активирующиеся ауксщом, деполяризацией мембраны, и ме- уянр^унгтнитртткткг^ В замыкающих клетках устьиц, например, анионные каналы от­крываются при падении мембранного потенциала от -80 до -20 мВ. Этому процессу способствует IP3, который вызывает повышение концентрации кальция в цитоплазме и активацию Са-зависимых К⁺-каналов.

Потенциал- и Са-зависимые анионные каналы обнаружены и в тонопласте. На осно­вании различий в проницаемости и селективности выделяют медленные (slow vacuolar, SV) и быстрые вакуолярные (fast vacuolar, FV) каналы. Следует отметить, что для анионных каналов характерна более высокая проницаемость для катионов, чем для анионов. Это объясняется, по-видимому, тем, что передвижение аниона через канал происходит только вместе с катионом, поскольку селективный фильтр канала, вероят­но, представлен анионной группой. При этом SV-тип анионных каналов более специ­фичен к анионам, чем к катионам, и лучше проницаем для нитрата, чем для хлорида. Более высокая проницаемость для нитрата анионных каналов тонопласта, чем для С1~, по-видимому, связана с высоким содержанием NOJ в вакуоли.

В клетках растений наиболее эффективными блокаторами анионных каналов явля­ются стилъбеновые дериваты (DIDS и SITS), этакриновая и антрацен-9-карбоновая (А-9-С) кислоты, ионы Zn²⁺. Са-зависимые С1^_-каналы, видимо, более чувствительны к DIDS. Этакриновая кислота, Zn²⁺ и La³⁺ эффективнее блокируют С1~-каналы, ак­тивируемые при гиперполяризации мембраны. А-9-С угнетает работу и Са-зависимых С1~-каналов, и С1~-каналов, активируемых гиперполяризацией.

Механочувствительные ионные каналы. Фукционирование ионных каналов может зависеть от растяжения мембраны и ее смещения. Каналы, которые изменяют активность в зависимости от натяжения мембраны, называются механочувствителъ- ными.

Впервые Са²⁺-проводящие механочувствительные каналы были показаны на эндо- телиальных клетках, где они выполняют функции сенсора кровяного давления. Каналы с аналогичными свойствами были найдены в бактериях, грибах и высших растениях. В растениях механочувствительные Са-каналы выявлены методом петч-кламп в замы­кающих клетках устьиц и в плазмалемме эпидермиса лука. Активность их зависит от температуры, рН и мембранного потенциала.

Функционирование механочувствительных каналов происходит в тесном взаимодей­ствии с цитоскелетом. Предполагается, что чувствительность каналов к натяжению возрастает, если сила, приложенная к участку мембраны, концентрируется на канале посредством примембранного цитоскелета. Для этого механочувствительные Са-кана­лы с помощью специальных линкеров (белки анкиринового типа) прикрепляются к цитоскелету (актиновым филаментам). Выделяют два типа каналов, чувствительных к натяжению мембраны: SA-каналы (stretch-activated), активирующиеся при растяжении, и SI-каналы (stretch-inactivated), которые при растяжении мембраны инактивируются. В зависимости от объекта и типа клетки встречаются механочувствительные каналы, селективные к С1~, К⁺, Са²⁺ и другим двухвалентным катионам, проницаемые для моно- и двухвалентных катионов, и неселективные (или слабоселективные) для анионов и других катионов. Наиболее ча­сто в качестве ингибитора используют гадолиний (Gd³⁺), который обратимо блокирует работу механочувствительных каналов в микромолярных (10 мкМ) концентрациях. Од­нако необходимо иметь в виду, что гадолиний может блокировать также работу ионных каналов других типов.