1.2 Рианодиновый рецептор – основной элемент управления кальциевой динамикой в клетке

RyR-канал является гигантским макромолекулярным комплексом (рис. 1.4), тетрамером, объединяющим четыре субъединицы (полипептидные цепи) с молекулярной массой 567 кДа каждая [2, 13]. Активность RyR модулируется под действием растительного алкалоида рианодина из коры Ryania speciosa, что и определило его название «рианодиновый рецептор». Существуют три изоформы RyR-каналов: RyR1 (клетки скелетной мускулатуры и мозжечка), RyR2 (клетки сердечной мышцы и мозга), RyR3 (клетки гладкой мускулатуры). Они различаются по своей структуре и динамическим параметрам.

Как уже было сказано выше,RyR-каналы располагаются на мембране СР; при переходе в открытое состояние через них происходит высвобождение ионов Са²⁺ из просвета ТЦ (люмена). Согласно данным электронной микроскопии [12], RyR-канал имеет форму четырехлистника со стороной 27 нм (рис. 1.4).

В процессе открытия RyR-канала изменяется его конформационное (структурное) состояние: данный белок изменяется по форме и структуре, переходя в проводящее состояние (рис. 1.5).

На рисунке 1.6 приведены результаты экспериментальных исследований структуры мембраны СР [13]; видно, что на мембранах RyR-каналы объединены в кластеры (решетки) (от 100 до 300 каналов в каждой). Каналы в решетке упорядочены и находятся под определенным углом друг к другу, также экспериментальные данные многих исследовательских групп говорят о существовании взаимодействия между каналами в кластере благодаря наличию между ними специфических связывающих белков [12-15].

Из всего вышесказанного можно сделать следующие выводы:

• RyR-каналы имеют сложную молекулярную структуру и, соответственно, огромное количество степеней свободы.

• На мембране СР каналы образуют регулярную структуру решетки. Моделирование динамики RyR-каналов усложняется тем, что при разработке теории кластера RyR-каналов необходимо учесть взаимодействия между ними.

1.3 Эксперименты по изучению изолированных RyR-каналов

Изучая динамические особенности изолированных RyR-каналов независимо друг от друга несколько авторов исследовало поведение RyR-каналов в лабораторных условиях в липидных бислоях при постоянных концентрациях ионов Са²⁺ в растворе в условиях отсутствия кальциевой стимуляции [17-19]. Схема типичной установки представлена на рис. 1.7. В экспериментах раствор разделяется на две части липидным бислоем, имитирующим клеточную мембрану, в котором закрепляется RyR-канал. Та часть, которая соответствует люменальной стороне канала называется trans, цитозольной стороне – cis.

В работах [17-19] помощью подобных установок была проведена серия экспериментов по регистрации ионных токов, проходящих через одиночный канал при различных концентрациях Са²⁺ в растворе. Отсутствие тока указывало на нахождении канала в закрытом состоянии, а их присутствие – на его открытие.

Первым важнейшей особенностью RyR-канала как нанообъекта является стохастический характер процессов открытия/закрытия при постоянных значениях концентраций и[17-19].

Важной кинетической характеристикой поведения RyR-канала является вероятность пребывания канала в открытом состоянии (), равная отношению суммы времен пребывания в открытом состоянии к длительности эксперимента:. При разбиении сигналов на небольшие промежутки времениТ<500 мс в работе [19] исследовалась временная зависимость вероятности пребывания канала в открытом состоянии. Исследования показали неоднородность функции (рис.1.8).

График зависимости активности канала от времени можно разбить на участки (так называемые пучки (bursts)) с различной вероятностью нахождения канала в открытом состоянии. Данный эффект получил название модовой проводимости (Modal Gating) [21-23]. Так в работе [21] выявлены следующие моды проводимости RyR-канала: H (high ) – мода высокой активности,>0.1,L (low ) – мода низкой активности, 0<<0.1,I (inactivated mode) – мода нулевой активности, =0 (рис. 1.9).

Исследование зависимости вероятности пребывания канала в открытом состоянии от значения концентрации Са²⁺ в trans-части показало [15, 24, 25], что в ответ на повышение увеличивалась частота открытий канала и вероятность(рис. 1.10). Из данного экспериментального факта можно сделать непосредственный вывод, что вероятность открытия RyR-канала увеличивается с ростом концентрации Са²⁺ в люмене.

В ряде работ [15, 21, 24], исследовавших влияние концентрации на активность RyR-канала, показано, что при повышении концентрации Са²⁺ в цитозоле (< 10 мкM) наблюдается резкое повышение частоты открытий канала и, соответственно, увеличение вероятности открытия одиночного канала. Далее, при достижении определенного значения концентрации (> 100 мкM) происходит спад , то есть наблюдается процесс инактивации RyR-канала при повышенной концентрации цитозольного кальция (рис.1.11).

Уменьшение значения при высоких значениях cis[Ca] объясняется многими исследователями [12, 15, 21, 26] тем фактом, что, являясь Са²⁺-активируемым рецептором, RyR-канал имеет на cis-стороне два типа активных центров, способных связаться с ионами Са²⁺: активационный и инактивационный [26-28]. На рисунке 1.12 изображена классическая схема активации/инактивации канала [27].

Сложная регуляция RyR-канала кальцием впервые была обнаружена в работе [29] при проведении экспериментов в плоском липидном бислое. Показано, что резкое увеличение cis[Ca] (~ 1 мс) сначала быстро активирует одиночный RyR-канал до высокого уровня вероятности , а затем значениемедленно уменьшается со временем при фиксированной концентрации Са²⁺ (рис. 1.13). Этот эффект получил название адаптации канала к продолжительной стимуляции.

Следует отметить, что в экспериментальных работах повышение уровня cis[Ca] проводилось двумя способами: резкое повышение с помощью лазерного флэш-фотолиза [29-33] и постепенное повышение в растворе вблизи RyR-канала [34, 35]. Второй способ подразумевает градуальное повышение уровнявблизи активных частей канала вследствие диффузионных процессов.

Результаты экспериментов [35] по наблюдению эффекта адаптации при градуальном повышении говорят о том, что только в 30% реализаций обнаруживался эффект адаптации, в остальных 70% случаях понижения вероятности пребывания канала в открытом состоянии со временем не происходило (рис. 1.14). На основании этих фактов был сделан вывод: понижениесо временем зависит от скорости увеличения уровня.

На основе приведенных данных можно сделать следующие выводы:

• Результаты экспериментальных исследований указывают на стохастический характер динамики RyR-каналов при постоянных значенияхи .

• Зависимость вероятности от уровня имеет колоколообразный вид (при (0, 100) мкМвозрастает, при >100 мкМ уменьшается).

• Вероятность открытия RyR-каналов прямо пропорциональна концентрации Са²⁺ в люмене.

• При резком повышении значении наблюдается эффект сначала резкого повышения ,а затем медленного спада значения с течением времени до стационарного уровня – адаптация к продолжительной стимуляции.