40. Теоретические основы и практические методы разбавления и хранения спермы с/х ж-х.

Разбавление спермы. Вся работа по разбавлению спермы должна быть основана на положениях действующих инструкций и других нормативных документов. Разбавлять сперму нужно в течение 30 мин после ее получения и в том случае, если она соответствует требованиям инструкции по показателям подвижности и концентрации спермиев. В состав сред для разбавления спермы входят сахара (лактоза и др.), соли (цитрат натрия и др.), желток куриного яйца, антибактериальные препараты (спермосан-3), а также глицерин, предохраняющий клетки от отрицательного воздействия низких температур. Чтобы предупредить контаминацию микроорганиз­мами, разбавитель готовят в стерильном боксе. Некоторые компо­ненты не выдерживают нагревания (желток куриного яйца, глице­рин), поэтому стерилизовать их термическими способами нельзя. Компоненты растворяют в прокипяченной дистиллированной воде. Разбавитель хранят при температуре 35 "С не более 3...4 ч. Можно использовать и заранее подготовленную среду, хранящую­ся в стерильной упаковке.

Выбор разбавителя обусловлен способом хранения спермы. Традиционный способ хранения спермы — ее охлаждение до 2...5°С. В этом случае разбавленную сперму барана сохраняют в течение 24 ч, жеребца — 48 ч и быка — 79 ч после получения.

Сперму хряков хранят при температуре 16...20 °С, разбавляя ее средами, содержащими хелатон. Наиболее распространенной яв­ляется глюкозо-хелато-цитратная среда (ГХЦ), в состав которой входят следующие компоненты: глюкоза — 6 г, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты — 0,37 г, гидрокарбонат на­трия — 0,12 г, цитрат натрия — 3,6 г, спермосан-3 — 25...30 тыс. ЕД, вода дистиллированная — 100 мл.

После растворения всех компонентов, кроме спермосана, среду стерилизуют на водяной бане в течение 10 мин с момента закипа­ния воды. Затем охлаждают и добавляют спермосан, как описано ранее (приготовление ГЦЖ для разбавления спермы барана).

Сперму собаки хранят в холодильнике до 100 ч, но оптималь­ным сроком считают 36...48 ч.

Для кратковременного хранения сперму разбавляют в соотно­шении 1: 8 пастеризованным молоком, подогретым до 38...40 "С. Разбавленную сперму разливают в стерильные пробирки по 5... 10 мл, сверху наслаивают стерильный вазелин. Пробирки зак­рывают пропарафинированными пробками, оборачивают ватой и ставят в холодильник.

Сперму быка, предназначенную для хранения в виде необлицованных гранул, разбавляют лактозо-желточно-глицериновой сре­дой, в состав которой входит 11,5 г лактозы, 100 мл дистиллиро­ванной воды, 20 мл желтка куриного яйца, 5 мл глицерина, 50 тыс. ЕД. спермосана-3. Простерилизованный раствор лактозы охлаждают до 35...40 °С и добавляют остальные компоненты.

Перед замораживанием разбавленную сперму выдерживают в холодильнике при температуре 5 °С З...4ч. В это время, называемое периодом эквилибрации, выравниваются концентрации глицерина в среде и спермиях. Глицерин защищает спермии от действия низ­ких температур только при проникновении внутрь клеток.

Сперму быка и барана можно замораживать в виде необлицованных гранул на фторопластовой пластине. Объем лунок должен быть известен заранее, чтобы не измерять его в условиях низких температур. Пластину предварительно стерилизуют методом УФО или спиртовыми тампонами, затем погружают в жидкий азот и выдерживают в нем до прекращения кипения. После этого плас­тину укрепляют на расстоянии 5... 10 см от поверхности азота (при температуре —160...—170 °С) и в течение 2 мин быстро заполняют лунки спермой из пипетки или шприца (рис. 2.9). Затем пластину вновь погружают в жидкий азот на 1...2мин. После заморажива­ния спермы пластину поднимают из жидкого азота, гранулы спер­мы собирают в сачок или контейнер, пересыпают в охлажденный контейнер и переносят в сосуды Дьюара с жидким азотом.

Чтобы получить облицованные гранулы, сперму быка разбав­ляют в 2 этапа (средой № 1 и № 2) непосредственно в полиэтиле­новом спермоприемнике.

Среда № 1: 11%-й раствор лактозы — 63 мл (можно заме­нить таким же количеством 11%-го раствора сахарозы); желток куриного яйца – 30 мл, глицерин — 7 мл; спермосан-3 — 50... 90тыс.ЕД.

Среда № 2: вода дистиллиро­ванная — 100 мл; лактоза — 6 г (можно заменить таким же количе­ством сахарозы); цитрат натрия — 1,4 г; глицерин — 5 мл; спермо­сан-3 - 50...90 тыс. ЕД.

Спермоприемник соединяют с тонкостенной полимерной трубкой, в которую выдавливают разбавленную сперму. Заполнен­ную спермой трубку разделяют с помощью автомата ПРЖ на от­дельные дозы по 0,25...0,33 мл с герметизацией. Облицованные (герметизированные) гранулы помещают в алюминиевые контей­неры, которые закрывают поролоновыми пробками. Контейнеры закрепляют в обоймах специального устройства, которое помеща­ют в холодильник. После 4...6-часовой экспозиции при темпера­туре 2...5 "С обойму аппарата с контейнерами погружают в жидкий азот на 8... 10 мин и затем переносят в сосуд Дьюара для хранения. В полипропиленовых соломинках (пайеттах) сперму быка за­мораживают по 0,25 мл. Пайетты заполняют спермой, маркируют, укладывают на штативы и ставят на эквилибрацию на З...4ч при температуре 4 °С, замораживают на металлическом щите, темпера­тура которого —120...—130 "С, в течение 5 мин.

Сперму жеребцов можно замораживать в виде гранул, однако предпочтительнее замораживать в пакетах по 25 мл при толщине заполненного пакета 4...5 мм. Предва­рительно охлажденный пакет заполня­ют спермой. Особое внимание обраща­ют на герметичность. Если она нару­шена, при размораживании неизбежны разрывы пакета. Заполненные спермой пакеты маркируют, помещают в держатели поплавка, который опускают к поверхности жидкого азота (рис. 2.10). Выдержав пакеты в парах азота 5...7 мин, переносят в сосуды Дьюара для хранения.

Такензи Масатохи и др. разработали разбавитель для хранения спермы собаки в замороженном состоянии: 1 часть 6%-й глюкозы, 3 части сухого молока, 1 часть секайнана-А и 600...900 ЕД/мл пе­нициллина. Сперму разбавляют в соотношении 1: 4, 1: 8, замора­живают в пайеттах, хранят в жидком азоте 2...12 мес.

Очень важно определить степень разбавления, то есть соотно­шение спермы и добавляемой среды. Обычно соотношение выра­жают двумя цифрами, первая из которых всегда единица, а вторая показывает, сколько миллилитров среды следует добавить к каж­дому миллилитру эякулята.

Хранение спермы. В настоящее время для длительного хранения спермы применяют замораживание. Только сперму хряков, раз­бавленную хелатными средами, сохраняют до 3 сут при температу­ре 16...20°С в термосах-ящиках (рис. 2.11) или бытовых сумках-холодильниках.

Сперму баранов, жеребцов и быков хранят при 2...5 °С в холо­дильниках, пищевых широкогорлых термосах или в специальных термосах, которые загружают тающим льдом. Флаконы, ампулы и др. заворачивают в вату или несколько слоев марли, складыва­ют в полиэтиленовые или резиновые мешочки и размещают в верхней части термоса, обложив по бокам льдом. Если в термосе есть отдельная секция, то, используя ее, необходимо своевремен­но сливать образующуюся воду и добавлять новые порции таю­щего льда.

Хранение замороженной спермы — очень ответственный этап в технологии искусственного осеменения. Замороженную сперму хранят в канистрах, которые подвешивают к горловине сосуда Дьюара и погружают в жидкий азот (—196 °С). Численность ка­нистр в зависимости от марки сосуда колеблется от трех до шести. Нельзя повторно замораживать сперму. Даже кратковременное повышение температуры до —125 °С, которое происходит при пе­ренесении спермы из одного сосуда Дьюара в другой или при низ­ком уровне жидкого азота в сосуде, приводит к ухудшению каче­ства спермы и даже к гибели клеток. В современных канистрах сосудов Дьюара предусмотрено не­большое боковое отверстие в средней части корпуса, поэтому при подъеме канистра остается до половины заполненной жид­ким азотом. С учетом указанной особенности спермодозы в ка­нистре не следует располагать выше бокового отверстия, благо­даря чему они всегда будут погружены в жидкий азот и, следова­тельно, не будут нагреваться и пор­титься. В сосуд Дьюара периодически нужно добавлять жидкий азот, кото­рый постоянно испаряется, чтобы не допустить понижения его уровня ниже критического. Согласно существующим правилам сосуд Дюара должен быть наполнен жид­ким азотом не менее чем на 1/3. Однако этому правилу надо сле­довать с некоторыми поправка­ми. Размеры канистр бывают разные, поэтому боковые отвер­стия могут располагаться на разном расстоянии от дна сосуда (14....20 см). Уровень жидкого азота в сосуде Дьюара не должен опускаться ниже боковых отверстий, иначе азот не будет зате­кать внутрь канистры. Доливать жидкий азот в сосуды Дьюара нужно с учетом расположения боковых отверстий на канистрах. Перед заполнением канистры следует измерить расстояние от ее крюка подвешивающего устройства до плоскости, проходя­щей перпендикулярно корпусу канистры, на уровне бокового отверстия. Чтобы азот затекал в канистру, необходимо, чтобы его уровень располагался выше отверстия не менее чем на 1 см. Контрольное число, показывающее предельно низкий уровень жидкого азота, получают, вычитая единицу (1 см) из измерен­ного расстояния.

Уровень жидкого азота удобно контролировать с помощью длинной линейки (Осташко Ф. И. и др.), при этом измерять сле­дует дважды. Чтобы ускорить работу, можно ограничиться единственным измерением по следующей методике. Линейку нулевым делением вниз опускают плавно через горловину сосуда. При ка­сании конца линейки поверхности жидкого азота последний вскипает и издает характерный шипящий звук; услышав его, ли­нейку перестают опускать, фиксируют расстояние, на которое опустилось ее нулевое деление в сосуд Дьюара. Затем сравнивают полученный результат с контрольным числом. Если измеренное расстояние приближается к контрольному числу, то необходимо добавить жидкий азот.