VI. Ориентировочная основа действия

Определение группы крови проводят в помещении с удовлетворительным освещением при температуре +15-25^оС. Используют цельную кровь, отмытые эритроциты, эритроциты в плазме, сыворотке или в 0,09% растворе натрия хлорида, стандартные сыворотки О(І), А(ІІ),В(ІІІ) двух разных серий каждой группы и стандартная сыворотка группы АВ(IV). Стандартные сыворотки для определения групп крови изготовляют в специальных лабораториях. Сыворотки сохраняют в холодильнике при температуре +(6±2)^оС.

Стандартные эритроциты готовят из крови доноров. Кровь от доноров забирают в количестве 2-4 мл в пробирку, что содержит цитрат натрияили гепарин. Потом в пробирку доливают 0,9% раствор натрия хлорида до 10 мл и содержимоецентрифугируют. Надосадоксливают и добавляют 0,9% раствор натрия хлорида к начальному объему крови и используют как стандарт при определении групп крови перекрестным методом. Стандартные эритроциты сохраняют в холодильнике при температуре +(6±2)^оС. Срок сохранения 3 суток. Стандартные эритроциты можно получить в готовом виде в заведениях службы крови, которые изготовляют эти стандарты.

Моноклональные антитела анти-А и анти-В предназначенные для определения группы крови по системе АВО вместо стандартных изогемаглютинующих сывороток. Моноклональные антитела анти-А и анти-В продуцируются двумя разными гибридами и являются разведенной асцитическойжидкостью мышей-носителей,укоторой находятся специфические иммуноглобулины класса М (направлены против групоспецифическихантигеновАиВчеловека).

Для определения группы крови необходимы:

1. изотонический раствор (0,9%) натрия хлорида

2. белые фарфоровые или другие пластинки, предметные стёкоасссмачиваемой поверхностью

3. пробирки

4. пипетки

5. стеклянные палочки

6. вата гигроскопическая

Техника определения группы крови посредством стандартных сывороток.

1. Пометить на планшетке группы крови „О” „А” „В” и фамилия реципиента или номер флаконадонора.

2. Под соответствующими отметками нанести по одной большой капле (0,1 мл) каждой сыворотки обеих серий.

3. Рядом с каждой сывороткой нанести по 1 маленькой капле (0,01 мл) исследуемой крови (эритроцитов).

4. Смешать отдельными стеклянными палочками каждую каплюкрови (эритроцитов) с соответствующей сывороткой.

5. Смешав все капли пластинку покачивают, потом на 1-2 мин оставляют и опять покачивают. Наблюдения за ходом реакции проводят не менее чем 5 мин, хотя агглютинация начинается уже в течение первые 10-30 сек. Наблюдение необходимо продолжать дальше до 5 мин, потому что возможная поздняя агглютинация, например с эритроцитами группы А.

6. Через 3-4 мин к каплям смеси сыворотки с эритроцитами, где произошла агглютинация добавляют по 1 капле(0,05 мл) 0,9% раствора натрия хлорида и продолжают наблюдать до 5 мин при периодическом покачивании пластинки.

Методика определения группы крови системы АВО моноклональными антителами.

Определение групп крови системы АВО моноклональными реагентами (цоликлоны анти-А и анти-В) проводится на планшетках. Так как цоликлоны имеют высокую активность, то для каждого определения крови достаточно применять по одной серии реагентов анти-А и анти-В. Цоликлоны анти-А и анти-В наносят на планшетку по одной большой капле под соответствующими надписями: анти-А и анти-В и смешивают с кровью, которая исследуется.

Результаты реакции представлены в таблице, в которую включенные результаты определения аглютининов в плазме доноров с помощью стандартных эритроцитов.

Реакция эритроцитов, что исследуются с цоликлонами Анти-А Анти-В		Реакция плазмы, что исследуется со стандартными эритроцитами А(ІІ) В(ІІ)		Группа крови, что исследуется
1) – –	+ +		0(І)
2) + –	– +		А(ІІ)
3) – +	+ –		В(ІІ)
4) + +	– –		AB(IV)

1) Агглютинации нет (–) ни с цоликлоном анти-А, ни с цоликлоном анти-В. Следовательно эритроциты, которыеисследуются не носят в своем составе антигеновАи В и кровь относится к О(І) группы. Это подтверждается наличием аглютининовв сыворотке,котораяисследуется по результатам позитивной реакции со стандартными эритроцитами а(ІІ) и В(ІІІ).

2) Агглютинация (+) наблюдается только с цоликлонами анти-А. Следовательно, эритроциты, которые исследуются, носят в своем составе только антиген А. Кровь относится к группе А(ІІ). Это подтверждается наличием агглютинации сыворотки,котораяисследуется (плазмы) по результатам позитивной реакции агглютинации со стандартными эритроцитами группы В(ІІІ).

3) Агглютинация (+) наблюдается только с цоликлонами анти-В. Следовательно, в эритроцитах, которые исследуются, содержится антиген В и кровь относится к группе В(ІІІ). Это подтверждается позитивной реакцией агглютинации сыворотки (плазмы), что исследуется, со стандартными эритроцитами. группы А(ІІ).

4) Агглютинация (+) наблюдается как с цоликлоном анти_А, так и с цоликлоном анти-В. Следовательно, кровь, которая исследуется, относится к АВ (IV) группе. Это подтверждается отсутствием аглютининов в сыворотке (плазме), что исследуется, по результатам отсутствия агглютинации со стандартными эритроцитами групп А и В(III).

Методика определения резус-фактора экспресс-методом с использованием стандартного универсального реагента антирезус Д.

Экспресс-метод определения резус-фактора используют в экстренных случаях. Под соответствующими отметками по 1 капле 0,1 мл. тестовой и контрольной сывороток. Добавляют половинный объем опытной крови и перемешивают. Тарелку покачивают 3-5 минут, потом читают результат. При наличии агглютинации эритроцитов с сывороткой антирезус кровь резус-позитивна, при отсутствии агглютинации – резус-негативная.

Методика определения антигенов системы резус посредством моноклональных антител (цоликлоны анти-Д супер).

На стеклянную плоскость наносят 2 капли тест-реагента анти-резус (0,1 мл) и 1 каплю крови, которая исследуется (0,05 мл) и тщательным образом смешивают. Через 20-30 секунд начинают покачивать плоскость. Четкая агглютинация наблюдается уже через 60 секунд. Результат реакции следует учитывать через 3 мин. Наличие агглютинации в крови, что исследуется указывает на наличие резус-позитивных эритроцитов, отсутствие – на наличие резус-негативных эритроцитов.

Методика проведения проб на совместимость.

1. Проба на индивидуальную совместимость по группе крови системы АВО.

Проба на совместимость по группам крови системы АВО выполняется согласно правила Стенберга „Аглютинуются эритроциты донора сывороткой реципиента”. Сыворотку реципиента, которую получают путем центрифугирования или отстаивания на планшетке смешивают с эритроцитами донора и покачивают в течение 5 мин. Отсутствие агглютинации эритроцитов донора сывороткой реципиента свидетельствует о совместимости крови по системе АВО, наличие агглютинации – о её несовместимости. Безусловно, переливание несовместимой крови приведет к агглютинации в кровяном русле и возникновению гемотрансфузионного шока. Такую кровь переливать нельзя. Реакция агглютинации указывает на то, что группа крови определена неправильно и нужно вернуться к определению группы крови. Если донор и реципиент одной группы, то такая реакция не возникает, ведь можно переливать лишь одногрупную кровь.

При отсутствии реакции агглютинации (кровь по системе АВО совместима) приступают к следующей пробе.

2. Проба на совместимость по резус-фактору.

Классической пробой на резус-совместимость является проба Соловьёвой.

Каплю сыворотки реципиента смешивают с эритроцитами донора в соотношении 10:1 в чашке Петри, ставят на водяную баню на 10 мин. при температуре 46-48^оС. При наличии агглютинации кровь несовместимая по резус-фактору, и поэтому такую кровь переливать нельзя, ведь можно переливать только кровь однорезуса, то при определении Rh-фактора возникла ошибка. Чаще ошибка возникает при определении Rh-фактора у реципиента экспресс-методом. Резус-фактор определяют более точными лабораторными методами на станции переливания крови. Наличие агглютинации при определении резус-совместимости требует возвращения к определению Rh-фактора у реципиента и донора. Отсутствие агглютинации указывает на совместимость крови по Rh-фактору и можно проводить последнюю пробу для реципиента.

В наше время совместимость по резус-фактору проводят видоизмененными пробами:

а) Проба на совместимость крови по Rh-фактору с использованием 33% раствора полиглюкина.

Проба проводится в пробирке без нагревания в течение 5 мин. На дно пробирки вносят 2 капли сыворотки больного, 1 каплю донорской крови и 1 каплю 33% раствора полиглюкина. Содержимое пробирки встряхивая смешивают, потом пробирку размещают почти горизонтально и медленно прокручивают таким образом, чтоб содержимое растекалось по стенкам пробирки. Такую процедуру продолжают 5 мин. Потом в пробирку добавляют 3-4 мл изотонического раствора натрия хлорида, смешивают путем 2-3-кратного переворачивания пробирки и проглядывают через свет невооруженным глазом. Оценка результатов. Наличие агглютинации эритроцитов на фоне прозрачной жидкости указывает на то, что кровь донора и реципиента несовместимые по резус-фактору. Если содержимое пробирки равномерно окрашивается без признаков агглютинации эритроцитов, кровь донора совместима с кровью реципиента по резус-фактору.

б) Проба на совместимость по резус-фактору с использованием 10% раствора желатина.

Пробу проводят в пробирках при температуре 46-48^оС в течение 10 мин. На дно пробирки вводят 1 каплю эритроцитов донора, которые отмыты десятикратным изотоническим раствором хлорида натрия, потом добавляют 2 капли подогретого раствора желатина и 2-3 капли сыворотки реципиента. Содержимое пробирки смещают и ставят на водяную баню при температуре 46-48^оС на 10 мин. Потом пробирку вынимают из водяной бани и добавляют 5-8 мл изотонического раствора натрия хлорида. Пробирку 2-3 раза переворачивают и оценивают реакцию невооруженным глазом или через лупу. Оценка реакции. Наличие агглютинации на фоне освещенной жидкости означает, что кровь несовместимая по Rh-фактору и ее нельзя переливать. Если содержимое пробирки равномерно окрашено и не определяется агглютинация, то кровь совместимая по резус-фактору и поэтому ее можно переливать.

3. Биологическая проба.

Перед переливанием препаратов крови контейнер или бутылку с эритроцитарной массой, плазмой нужно выдержать при комнатной температуре 30-40 мин., а в безотлагательных случаях подогреть на водяной бане при температуре 37^о.С Биологическую пробу проводят независимо от скорости введения (струйкой или капельно) следующим методом. Струйкой переливают 10-15 мл препаратов крови, потом в течение 3 мин. наблюдают за состоянем больного. При отсутствии клинических проявлений реакций и осложнений (увеличение частоты пульса, дыхания, появление одышки, гиперемии лица) пробу повторяют трижды. Отсутствие реакций и осложнений после проведения биологической пробы является основным для переливания основной дозы препаратов крови. В случае возникновения клинических признаков реакции или осложнений (поведение больного беспокойно, появляется лихорадка, сжатие за грудиной, боль в поясничной области, животе, головная боль, снижение артериального давления, тахикардия, бледность кожи, со следующим цианозом) необходимо прекратить переливание, приготовить другую одноразовую систему для переливания солевых растворов и не выходя иглой с вены начать переливать солевой раствор.