598 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.6.84.Котрансляционноесворачиваниебелка.Нарисункепоказано,какрастущаяполипептидная цепь приобретает вторичную и третичную структуры по мере появления из рибосомы. Сначала свора- чиваетсяN-концевойдомен,втовремякакС-концевойдоменещесинтезируется.Дотехпорпокаэтот белокневысвободитсяизрибосомы,оннепринимаетконечнуюконформацию.(Взятосмодификациями изA. N. FederovandT. O. Baldwin,J.Biol.Chem.272:32715–32718,1997.)
агрегировали бы и были бы сочтены клеткой как «отходы производства», не вмешайся туда шаперон (рис. 6.85).
Многие молекулярные шапероны названы белками теплового шока (обозначаются Hsp; heat-shock protein), потому что их синтез резко возрастает после того, как клетки подвергают кратковременному действию повышенной температуры (например, 42 °C для клеток, которые обычно живут при 37 °C). Это отражает действие системы обратной связи, которая реагирует на увеличение числа неправильно свернутых белков (типа тех, которые продуцируются при повышении температуры), наращивая синтез шаперонов, которые помогают этим белкам свернуться вновь и уже так, как надо.
Есть несколько главных семейств молекулярных шаперонов эукариот, в том числе белки Hsp60 и Hsp70. Члены различных семейств действуют в разных органеллах. Так, как еще будет сказано в главе 12, митохондрии содержат свои собственные молекулы Hsp60 и Hsp70, которые отличаются от тех, что работают
вцитозоле; а специальный Hsp70 (названный BIP) помогает сворачивать белки
вэндоплазматической сети.
Все белки из семейств Hsp60 и Hsp70, помогая другим белкам сворачиваться, работают со своими собственными маленькими наборами белков. Все белки Hsp обладают сродством к выставленным на поверхности гидрофобным участкам не полностью свернутых белков и гидролизуют ATP, быстро связывая и высвобождая белок-субстрат с каждым циклом гидролиза ATP. В других отношениях белки Hsp разных типов работают по-разному. Машина из белков Hsp70 действует на ранних стадиях образования многих белков, связываясь с цепочкой приблизительно из семи гидрофобных аминокислот до того, как белок оставит рибосому (рис. 6.86). Напротив, Hsp60-подобные белки образуют большую бочонкообразную структуру,
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 599
Рис.6.85.Современныйвзгляднафолдингбелка.Каждыйдоменнедавносинтезированногобелкабыстродостигаетсостояния«расплавленнойглобулы».Последующеесворачиваниепроисходитмедленнее иидетпомножествупутей,частоспривлечениеммолекулярныхшаперонов.Некоторыммолекуламвсе равно не удается свернуться правильно; как объяснено в тексте, определенные протеазы распознают такиемолекулыиподвергаютихдеградации.
которая действует после того, как белок полностью синтезирован. Шаперон такого типа, иногда называемый шаперонином (chaperonin), формирует «изоляционную камеру», в которую доставляются неправильно свернутые белки, агрегацию коих он предотвращает и предоставляет им благоприятную среду, в которой у них есть возможность исправиться и принять нужную форму (рис. 6.87).
Шаперонам, представленным на рис. 6.86 и 6.87, часто приходится осуществлять множество циклов гидролиза ATP, чтобы добиться правильной укладки очередной полипептидной цепи. Хотя часть этой энергии идет на выполнение механической работы, вероятно, намного больше ее расходуется на то, чтобы гарантировать надлежащий фолдинг белка в конце процесса. Точно так же, как мы видели на примерах транскрипции, сплайсинга и трансляции, затраченная свободная энергия может быть употреблена клетками на повышение точности биологического процесса. В случае белкового фолдинга гидролиз ATP позволяет
600 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.6.86.СемействоHsp70молекулярныхшаперонов.Этибелкидействуютнараннемэтапе,опознавая короткийотрезокгидрофобныхаминокислотнаповерхностибелка.Присодействиирядаболеемелких белковHsp40(непоказаны)связанныесATPмолекулыHsp70захватываютсвойцелевойбелокизатем гидролизуют ATP до ADP, претерпевая конформационные изменения, которые вынуждают молекулы Hsp70 связываться с мишенью еще прочнее. После того как Hsp40 отделяется, быстрое повторное связываниеATPиндуцируетдиссоциациюбелкаHsp70послевысвобожденияADP.Вдействительности повторныециклысвязыванияивысвобождениябелкаHspпомогаютцелевомубелкусвернутьсявновь (совершитьрефолдинг),каксхематичнопоказанонарис.6.85.
шаперонам распознать широкий круг ошибочно свернутых структур, остановить их дальнейшее сворачивание и возобновить фолдинг белка — уже по правильному пути.
Хотя наше обсуждение было сосредоточено на шаперонах только двух типов, клетка располагает и множеством других. Огромное разнообразие белков в клетках, как можно думать, требует наличия и широкого репертуара шаперонов с многоплановыми возможностями контроля и исправления.
6.2.19. Экспонированные гидрофобные области служат аварийными сигналами для проверки качества белка
Если в клетки на короткое время ввести радиоактивные аминокислоты, то можно проследить, как недавно синтезированные белки созревают до своей конечной функционально активной формы. Такого рода эксперименты показывают, что белки Hsp70 начинают действие первыми: когда белок еще продолжает синтезироваться на рибосоме; а Hsp60-подобные белки включаются в работу позже и помогают свернуться уже завершенным белкам. Но как клетка отличает неверно свернутые белки, которые требуют дополнительных циклов катализируемого ATP рефолдинга, от белков с правильными структурами?
Перед тем как ответить на данный вопрос, мы должны взять паузу, чтобы рассмотреть посттрансляционную судьбу белков в более широком ракурсе. Обычно, если на поверхности белка экспонирован протяженный участок гидрофобных аминокислот, то это ненормально: белок или не смог правильно свернуться после выхода из рибосомы, или в результате каких-то событий он частично развернулся позже, или же он был не в состоянии найти своего партнера-субъдиницу в более крупном белковом комплексе. Такой белок не просто бесполезен для клетки — он может быть опасен. Многие белки с чрезмерно экспонированной гидрофобной об-
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 601
Рис.6.87.СтруктураифункциясемействаHsp60молекулярныхшаперонов.а)Катализрефолдингабелка.
Ошибочносвернутыйбелоксначалаулавливаетсягидрофобнымивзаимодействиямипоодномуободу бочонка. Последующее связывание ATP плюс белковая крышка увеличивают диаметр обода бочонка,
врезультатечего«белок-клиент»можеткратковременнораспрямиться(частичноразвернуться).Кроме этого,белоктеперьзамкнутвограниченномпространстве,гдеонимеетвозможностьзановосвернуться. Примерно через 15 секунд происходит гидролиз ATP, ослабляющий комплекс. При последующем связыванииследующеймолекулыATPбелок,будьонсвернутилинет,извлекаетсяициклповторяется. Молекулярныйшаперонтакоготипаизвестентакжеподименемшаперонин;онобозначаетсякакHsp60
вмитохондриях,TCP1—вцитозолеклетокпозвоночныхиGroEL—убактерий.Какпоказанонарисунке, толькополовинасимметричногобочонкаобслуживаетбелкового«клиента»влюбоймоментвремени. б)СтруктураGroEL,связанногососвоейкрышкойGroES,—поданнымрентгеновскойкристаллографии. Слева показана внешняя сторона бочонкообразной структуры, а справа — продольный срез через ее центр. (Изображение б переработано на основании B. Bukau and A. L. Horwich, Cell 92: 351–366, 1998.
СлюбезногоразрешенияиздательстваElsevier.)
ластью могут образовывать в клетке огромные агрегаты. Мы увидим, что, в редких случаях, такие конгломераты и в самом деле образуются и вызывают серьезные заболевания у человека. Однако мощные механизмы «проверки качества» белка обычно предотвращают подобные бедствия.
Учитывая такую обстановку, никого не удивляет, что клетки выработали в ходе эволюции сложнейшие механизмы, которые распознают гидрофобные области на белках и сводят к минимуму наносимый ими урон. Два таких механизма зависят от только что описанных молекулярных шаперонов: они связываются с гидрофобной областью и пытаются «отремонтировать» (репарировать) дефектный белок, предоставляя ему очередной шанс свернуться. В то же время, покрывая гидрофобные области, эти шапероны кратковременно предотвращают образование агрегатов. Белки, которые сами очень быстро и правильно сворачиваются, не экспонируя гидрофобных областей, шапероны обходят стороной.
602 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.6.88.Процессыотслеживаниякачествабелкапослеегосинтеза.Недавносинтезированныйбелок иногда сворачивается правильно и самостоятельно объединяется со своими белками-партнерами — в таком случае механизмы «проверки качества» оставляют его в покое. Неправильно свернутым белкам помогают повторно свернуться (совершить рефолдинг) молекулярные шапероны: сначала белки из семейства Hsp70, а затем, в некоторых случаях, — Hsp60-подобные белки. Шапероны обоих типов опознаютсвоих«клиентов»поэкспонированномуучасткугидрофобныхаминокислотнаповерхности. Эти процессы «спасения белка» конкурируют с другим механизмом, который после опознавания аномальновыставленногогидрофобногоучасткапомечаетбелокдляразрушенияпротеасомой.Совокупное действие всех этих процессов необходимо для предотвращения в клетке массовой агрегации белков, чтоможетпроизойти,еслигидрофобныеобластимножествабелковнеспецифичнообъединятся.
На рис. 6.88 приведены все варианты проверки качества, которые клетка проводит в отношении недавно синтезированных белков, фолдинг которых затруднен. Как показано, когда попытки рефолдинга терпят неудачу, в действие приводится третий механизм — полное уничтожение белка путем протеолиза. Протеолитический путь начинается с опознавания аномальной гидрофобной области на поверхности белка и заканчивается отправкой всего белка на машину разрушения — это сложная протеаза, известная под названием протеасома. Как будет описано далее, этот процесс зависит от сложноорганизованной системы «маркировки» белков, которая выполняет также и другие очень важные функции в клетке, уничтожая определенные нормальные белки.
6.2.20. Протеасома представляет собой компартментализованную протеазу с изолированными активными участками
Протеолитические машины и шапероны соревнуются между собой за право реорганизации неправильно свернутого белка. Если недавно синтезированный белок сворачивается быстро, то лишь малая доля его подвергается деградации. Если же белок сворачивается медленно, то он представляет собой легко уязвимую мишень для протеолитической машины в течение длительного времени и поэтому намного большее число его молекул разрушается прежде, чем остатки достигнут надлежаще свернутого состояния. В силу мутаций или же вследствие ошибок транскрипции, сплайсинга и трансляции РНК некоторые белки никогда не сворачиваются должным образом. И очень важно, чтобы клетка уничтожала такие потенциально опасные белки.
Аппарат, который уничтожает аберрантные белки, представлен протеасомой (proteasome) — присутствующей в клетке в большом количестве АТР-зависимой
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 603
протеазой, которая составляет почти 1 % белка клетки. Присутствуя в многочисленных копиях, рассеянных всюду по цитозолю и ядру, протеасома уничтожает также и аберрантные белки эндоплазматического ретикулума (ЭР, ER; endoplasmic reticulum). Ориентированная на ER система надзора обнаруживает белки, которые не в состоянии ни свернуться, ни быть собранными должным образом при поступлении в ER, и ретротранслоцирует (retrotranslocates) их обратно в цитозоль для деградации (обсудим это подробнее в главе 12).
Протеасома состоит из центрального полого цилиндра (20S-кор протеасомы), образованного из многочисленных белковых субъединиц, которые собираются в виде квазицилиндрической трубки из четырех гептамерных колец (рис. 6.89). Некоторые из этих субъединиц представляют собой различные протеазы, активные участки которых обращены во внутреннюю камеру цилиндра. Такое строение протеасомы удерживает эти очень эффективные протеазы от слишком рьяной деятельности в клетке. Каждый конец цилиндра обычно связан с крупным белковым комплексом (19S-колпачок, или кэп), представляющим собой белковое кольцо из шести субъединиц, через которое белки-мишени как бы продергиваются и попадают в ядро протеасомы, где подвергаются деградации (рис. 6.90). Реакция «вдевания нити», движимая гидролизом ATP, разворачивает целевые белки по мере их продвижения сквозь колпачок, обнажая их перед протеазами, выстилающими ядро протеасомы (рис. 6.91). Белки, что составляют кольцевую структуру в колпачке протеасомы, принадлежат к большому классу белковых «анфолдаз» (unfoldases, что дословно значит «развертазы»), известных как ААА-белки. Многие из них функционируют как гексамеры, и вполне возможно, что механизм их действия сходен с ATP-зависимым раскручиванием ДНК ДНК-хеликазами (см. рис. 5.15).
Рис.6.89.Протеасома.а)Изображеннаявразрезеструктурацентрального20Sцилиндра,определенная рентгеноструктурныманализом,гдеактивныеучасткипротеазобозначеныкраснымиточками.б)Полная протеасома,вкоторойцентральный
цилиндр (желтый) дополнен 19Sколпачками(синие)накаждомкон-
це.Структураколпачкаопределена путем компьютерной обработки полученных на электронном микроскопе изображений. Комплекс колпачка (также называемый регуляторной частицей) избирательно связывает белки, которые помече- ныубиквитином—меткойдляраз- рушения; после этого протеасома
использует гидролиз ATP для разворачивания полипептидной цепи этих белков и пропускает их через узкий канал (см. рис. 6.91) во внутреннююкамеру20Sцилиндрадля перевариваниядокороткихпептидов.(Изображениебзаимствовано из W. Baumeister et al., Cell 92: 367–
380,1998.Слюбезногоразрешения издательстваElsevier.)
604 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 6.90. Процессивное расщепление белка протеасомой. Колпачок протеасомы опознает белок-
субстрат, в данном случае помеченный полиубиквитиновой цепью (см. рис. 6.92), и впоследствии перемещает его в ядро (кор) протеасомы, где он и расщепляется. На ранней стадии убиквитин отщепляетсяотбелковогосубстратаирециклизуется.Транслокациявкорпротеасомыопосредуетсякольцом ATP-зависимыхбелков,которыеразворачиваютбелковыйсубстратпомереего«продергивания»через кольцоидалее—вядропротеасомы(см.рис.6.91).(ЗаимствованоизS. PrakashandA. Matouschek,Trends Biochem.Sci.29:593–600,2004.СлюбезногоразрешенияиздательстваElsevier.)
Важнейшее свойство протеасомы (и одна из причин сложности ее строения) заключается в процессивности ее механизма: в отличие от «простой» протеазы, которая расщепляет полипептидную цепь субстрата только единожды перед тем как отсоединиться, протеасома удерживает субстрат связанным, пока весь он не будет разбит на короткие пептиды.
19S-колпачки действуют как регулируемые «створки» на входе во внутреннюю протеолитическую камеру и отвечают за связывание целевого белка-субстрата с протеасомой. За некоторыми исключениями, протеасомы воздействуют на белки, которые специфически помечены для разрушения: к ним ковалентно присоединены «опознавательные метки» (тэги), образованные маленьким белком, называемым убиквитином (рис. 6.92, а). Убиквитин находится в клетках или в свободном виде, или ковалентно связан с каким-либо из множества разных внутриклеточных белков. Для многих белков мечение убиквитином заканчивается их разрушением в протеасоме. Однако в других случаях мечение убиквитином имеет совершенно иное значение. В конечном счете, именно число присоединенных убиквитиновых молекул и способ, которым они связаны друг с другом, и определяют, как клетка истолкует такое убиквитиновое послание (рис. 6.93). В последующих пунктах мы акцентируем внимание на роли убиквитинирования в деградации белков.
6.2.21. Сложноорганизованная убиквитин-конъюгирующая система помечает предназначенные для расщепления белки
Подготовку убиквитина для конъюгации с другими белками проводит
ATP зависимый убиквитин-активирующий фермент (Е1) — он создает активи-
рованный Е1-связанный убиквитин, который впоследствии передается одному из
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 605
Рис. 6.91. Гексамерная белковая анфолдаза («раз-
вертаза»). а) Структура образована из шести субъединиц, каждая из которых принадлежит к семейству
ААА-белков. б) Модель действия ААА-белка как ATP- зависимойанфолдазы.АТР-связаннаяформагексамер- ного кольца AAA-белков связывает свернутый белоксубстрат, который «приговорен» к разворачиванию (ипоследующемуразрушению),таккакнанемопозна- вательнаяметка—такаякакполиубиквитиноваяцепь (см. ниже) или пептид, прикрепляемый для отметки неполностьюсинтезированныхбелков(см.рис.6.81). Конформационноеизменение,протекающеенеобратимо за счет гидролиза ATP, втягивает субстрат в центральноеядро(кор)истягиваеткольцевуюструктуру. Вэтотмоментвтягиваемыйтудабелок-субстратможет частичноразвернутьсяи войтивглубьпоры,аможет сохранить свою структуру и от-
делиться.Дляоченьстабильных белковых субстратов могут потребоватьсясотницикловгидро-
лизаATPидиссоциации,прежде
чем они будут успешно втянуты в ААА-кольцо. Будучи, наконец, развернут, белок-субстрат продвигается относительно быстро
через пору за счет последовательных циклов гидролиза ATP. (Изображение а заимствовано
из X. Zhang et al., Mol. Cell 6: 1473–1484,2000,иA. N. Lupasand J. Martin, Curr. Opin. Struct. Biol.
12: 746–753, 2002; схема б — изR. T. Saueretal.,Cell119: 9–18,
2004. На все это было получено любезноеразрешениеиздатель-
стваElsevier.)
606 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.6.92.Убиквитинимаркированиебелковполиубиквитиновымицепями.а)Трехмернаяструктура убиквитина; этот относительно малый белок содержит 76 аминокислот. б) C-конец убиквитина первоначально активируется присоединением к боковой цепи цистеина белка Е1 посредством высокоэнергетической тиоэфирной связи. Эта реакция требует ATP и протекает через ковалентный промежуточный продукт AMP–убиквитин. Затем активированный убиквитин, связанный с Е1, также известным как убиквитин-активирующий фермент, переносится на цистеины ряда молекул E2. Эти молекулы E2 существуют в виде комплексов с еще более крупным семейством молекул E3. в) Присоединение полиубиквитиновой цепочки к целевому белку. В клетке млекопитающих находится несколько сотен различныхкомплексовE2–E3,многиеизкоторыхузнаютспецифическийсигналдеградациинацелевых белках посредством компонента E3. Молекулы E2 называют убиквитин -конъюгирующими ферментами. Ферменты E3 традиционно упоминались как убиквитинлигазы, но более корректно оставить это название за функционально активными комплексами E2–E3. Подробная структура такого комплекса представленанарис.3.79.
Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 607
Рис.6.93.Маркированиебелковубиквитином.Каждаяизпредставленныхсхеммодификацииможет нести определенное значение для клетки. Оба типа полиубиквитинирования отличаются способом соединения молекул убиквитина между собой. Связь через Lys48 означает деградацию в протеасоме, тогда как при соединении через Lys63 имеет другие значения. Убиквитиновые метки «считываются» белками,которыеспецифичноузнаютмодификациюкаждоготипа.
набора убиквитин-конъюгирующих (E2) ферментов (рис. 6.92, б). Ферменты E2 действуют в одной связке с дополнительными белками (E3). В комплексе E2–E3, названном убиквитинлигазой, компонент E3 связывается со специфическими сигналами к деградации, названными дегронами, в белковых субстратах, помогая ферменту E2 сформировать полиубиквитиновую цепь, связанную с лизином белка-субстрата. В такой цепочке С-концевой остаток каждого убиквитина связан с определенным лизином предыдущей убиквитиновой молекулой (см. рис. 6.93), в результате чего получается линейная цепочка убиквитин–убиквитиновых конъюгатов (рис. 6.92, в). Именно такая полиубиквитиновая цепь на целевом белке
иопознается специфическим рецептором в протеасоме.
Умлекопитающих существует примерно 30 структурно подобных, но разных ферментов E2 и сотни различных белков E3, которые образуют комплексы с определенными ферментами E2. Таким образом, система убиквитин–протеасома состоит из множества различных, но подобным образом организованных протеолитических путей, причем их общими составляющими являются как фермент Е1 на «верхушке», так и протеасома в «основании»; а отличаются они составом входящих в них убиквитинлигаз E2–E3 и набором дополнительных факторов. Различные убиквитинлигазы опознают разные сигналы деградации и поэтому нацелены на разрушение разных субпопуляций внутриклеточных белков.
Денатурированные или по какой-либо иной причине неправильно свернутые белки, равно как и белки, содержащие окисленные или иные аномальные аминокислоты, опознаются и разрушаются, потому что на поверхности аберрантных белков, как правило, экспонированы аминокислотные последовательности или конформационные мотивы, которые распознаются «отрядом» молекул E3 в системе убиквитин–протеасома как сигналы деградации; в нормальных вариантах этих белков такие последовательности должны, конечно, быть погружены вглубь и поэтому будут недоступны. Однако машины протеолиза, которые опознают и уничтожают аномальные белки, должны обладать способностью отличать завершенные бел-
