Volume1

Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 589

археи и эукариоты имеют в наличии двадцать первую аминокислоту, которая может быть включена непосредственно в растущую полипептидную цепь посредством рекодирования трансляции. Селеноцистеин, который абсолютно необходим для эффективной работы самых разных ферментов, содержит атом селена на месте атома серы в цистеине. Селеноцистеин производится ферментативно из серина, присоединенного к молекуле специальной тРНК, спариваюшейся своими основаниями с кодоном UGA, который обычно сигнализирует остановку трансляции. Молекулы мРНК для белков, в которые на кодоне UGA должен быть вставлен селеноцистеин, несут дополнительную нуклеотидную последовательность поблизости от него, которая и вызывает такое событие перекодирования (рис. 6.77).

Рис. 6.77. Включение селеноцистеина в растущую полипептидную цепь. Специализированная тРНК загружается серином при содействии обычной серил-тРНК-синтетазы, и серин впоследствии ферментативно преобразуется в селеноцистеин. Определенная структура в мРНК (структура стебля и петли соспецифическойпоследовательностьюнуклеотидов)сигнализирует,чтоселеноцистеиндолженбыть вставленусоседнегоUGA-кодона.Какпоказанонасхеме,этособытиетребуетучастияселеноцистеин- специфичногофакторатрансляции.

Другая форма перекодировки, сдвиг рамки считывания при трансляции

(translation frameshifting), позволяет синтезировать с одной мРНК более одного белка. Ретровирусы — члены большой группы патогенов, инфицирующих эукариот, — обычно используют сдвиг рамки считывания при трансляции, чтобы производить белки капсида (белки Gag), а также обратную транскриптазу и интегразу (белки Pol) вируса с одного РНК-транскрипта (см. рис. 5.73). Вирусу нужно намного больше копий белков Gag, чем таковых белка Pol. Такое количественное урегулирование достигается

590 Часть 2. Основные генетические механизмы

за счет кодирования генов Pol сразу после генов Gag, но в другой рамке считывания. Небольшие количества продуктов гена Pol производятся ввиду того, что эпизодически происходящий выше сдвиг рамки считывания при трансляции позволяет пропускать стоп-кодон белка Gag. Этот сдвиг рамки считывания происходит в определенном кодоне мРНК и требует специфического сигнала рекодирования (recoding signal), который, по-видимому, является структурной особенностью последовательности РНК, расположенной ниже участка этого кодона (рис. 6.78).

Рис.6.78.Сдвиграмкисчитывания,которыйобеспечиваетсинтезобратнойтранскриптазыиинтегразы ретровируса.Присущиевирусуобратнаятранскриптазаиинтегразаполучаютсяврезультатепротеоли- тическогопроцессингакрупногобелка-предшественника(слитныйбелокGag–Pol),состоящегоизами- нокислотных последовательностей белков Gag и Pol. Протеолитический процессинг экспрессируемого в огромных количествах белка Gag приводит к образованию белков вирусного капсида. И белок Gag, и слитный белок Gag–Pol начинаются с идентичной мРНК, но если белок Gag заканчивается на стоп- кодоне,расположенномнижепоказаннойпоследовательности,тотрансляцияслитногобелкаGag–Pol обходит этот стоп-кодон, приводя к синтезу более длинного продукта. Пропуск стоп-кодона возможен благодаряконтролируемомусдвигурамкисчитыванияпритрансляции,какпоказанонасхеме.Особенности, заложенные в локальной структуре РНК (включая показанную петлю РНК), приводят к тому, что тРНКLeu,присоединеннаякC-концурастущейполипептиднойцепи,иногдасоскальзываетнарибосоме назаднаодиннуклеотидтакимобразом,чтооказываетсяспареннойскодономUUUвместокодонаUUA, который первоначально задал ее включение в полипептидную цепь; следующий кодон (AGG) в новой рамке считывания определяет аргинин, а не глицин. Такое контролируемое скольжение обусловлено отчастипсевдоузлом,которыйобразуетсянавирусноймРНК(см.рис.6.102).Нарисункепредставлена последовательность вируса СПИД человека, ВИЧ (Переработано из T. Jacks et al., Nature 331: 280–283, 1988.СлюбезногоразрешенияиздательстваMacmillanPublishersLtd.)

6.2.14.  Ингибиторы синтеза белка прокариот как антибиотики

Многие из наиболее действенных антибиотиков, применяемых в современной медицине, представлены соединениями, которые выделяются грибами и характеризуются тем, что замедляют синтез бактериальных белков. Грибы и бактерии конкурируют за многие из населяемых ими экологических ниш, и за миллионы лет совместной эволюции грибы научились вырабатывать сильнодействующие ингибиторы против бактерий. Некоторые из таких лекарств основаны на структурных и функциональных различиях между рибосомами бактерий и эукариот — с тем

Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 591

чтобы избирательно препятствовать работе бактериальных рибосом. Таким образом, люди могут принимать высокие дозы некоторых из таких соединений без риска неспецифической токсичности. Многие антибиотики занимают карманы в рибосомных РНК и попросту мешают слаженной работе рибосомы (рис. 6.79). В таблице 6.4 перечислены некоторые из наиболее известных антибиотиков этого типа наряду с некоторыми другими ингибиторами синтеза белка — некоторые из них воздействуют на клетки эукариот и поэтому не могут применяться в качестве антибиотиков.

Рис. 6.79. Сайты связывания антибиотиков на бактериальной рибосоме. Малая (слева) и большая

(справа) субчастицы рибосомы расположены так, как если бы рибосома была открыта подобно книге; связанныемолекулытРНКпредставленывфиолетовомцвете(см.рис.6.64).Большинствоизпоказанных антибиотиков связывается непосредственно с карманами, образованными молекулами рибосомной РНК.ГигромицинBвызываетошибкивтрансляции,спектиномицинблокируетперемещениепептидилтРНК из A-участка в P-участок, а стрептограмин B препятствует элонгации синтезируемых пептидов. В таблице 6.4 приведено описание механизмов ингибирования, присущих другим антибиотикам, по-

казанныминарисунке.(ПереработаноизJ. PoehlsgaardandS. Douthwaite,Nat.Rev.Microbiol.3: 870–881,

2005.СлюбезногоразрешенияиздательстваMacmillanPublishersLtd.)

Поскольку многие соединения из приведенных в таблице 6.4 блокируют определенные операции в процессах, которые ведут от ДНК к белку, они используются для исследований в области клеточной биологии. Среди наиболее широко применяемых в таких исследованиях препаратов мы упомянем хлорамфеникол, циклогексимид и пуромицин — все они специфически ингибируют синтез белка. В клетке эукариот, например, хлорамфеникол ингибирует синтез белка на рибосомах только в митохондриях (и в хлоропластах у растений), что, возможно, отражает происхождение этих органелл от прокариот (обсудим это в главе 14). Циклогексимид, напротив, затрагивает только рибосомы в цитозоле. Пуромицин особенно интересен, потому что это структурный аналог молекулы тРНК, связанной с аминокислотой, так что он дает нам еще один пример молекулярной мимикрии; рибосома ошибочно принимает его за подлинную аминокислоту и ковалентно связывает с C-концом растущей пептидной цепи, таким образом вызывая преждевременное завершение

Примечание. Рибосомы в митохондриях (и хлоропластах) эукариот по своей чувствительности к ингибиторам часто близки к рибосомам прокариот. Следовательно, некоторые из этих антибиотиков могут оказывать вредное воздействие на митохондрии человека.

и высвобождение полипептида. Как и следовало ожидать, пуромицин ингибирует синтез белка как у прокариот, так и у эукариот.

6.2.15.  Точность трансляции требует затрат свободной энергии

Осуществляемая рибосомой трансляция есть компромисс между противоречивыми ограничениями точности и скорости. Мы уже видели, например, что точность трансляции (1 ошибка на 104 соединенных аминокислот) требует задержки во времени каждый раз, когда новая аминокислота добавляется к растущей полипептидной цепи, в силу чего общая скорость трансляции снижается и составляет у бактерий 20 присоединенных аминокислот в секунду. Мутантные бактерии с определенным изменением в малой субчастице рибосомы делают более продолжительные паузы и транслируют мРНК в белок с гораздо более высокой точностью, чем приведенная выше цифра; однако синтез белка у таких мутантов протекает столь медленно, что бактерии едва успевают выжить.

Мы узнали также и то, что достижение наблюдаемой точности синтеза белка требует затрат большого количества свободной энергии; это вполне оправданно, ибо, как мы рассуждали в главе 2, существует определенная цена, которую клетка должна платить за любое увеличение порядка в своих владениях. В большинстве клеток синтез белка потребляет больше энергии, чем любой другой процесс биосинтеза. Так, для образования каждой новой пептидной связи необходимо расщепить, по крайней мере, четыре высокоэнергетические фосфатные связи: две потребляются при загрузке молекулы тРНК аминокислотой (см. рис. 6.56) и еще две идут на осуществление операций в цикле реакций, происходящих на рибосоме во время

Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 593

собственно синтеза (см. рис. 6.67). Вдобавок к этому дополнительная энергия расходуется каждый раз, когда связь с неправильной аминокислотой гидролизуется тРНК-синтетазой (см. рис. 6.59), и каждый раз, когда неправильная тРНК входит в рибосому, запускает гидролиз GTP и она выбраковывается (см. рис. 6.67). Для обеспечения эффективности такие корректирующие механизмы должны допускать также и удаление заметной доли правильных взаимодействий; по этой причине коррекция оказывается еще более затратной по энергии, чем может казаться.

6.2.16.  Механизмы контроля качества действуют таким образом, чтобы предотвратить трансляцию поврежденных молекул мРНК

У эукариот производство мРНК включает в себя как транскрипцию, так и ряд сложных операций процессинга РНК; последние протекают в ядре, отдельно от рибосом, и только по окончании «обработки» молекулы мРНК транспортируются в цитоплазму для последующей их трансляции (см. рис. 6.40). Однако эта схема не защищена от ошибок и некоторые неправильно процессированные молекулы мРНК по недосмотру все-таки отправляются в цитоплазму. Кроме того, молекулы мРНК, которые были безупречны, когда покидали ядро, могут под действием какихлибо факторов разорваться или повредиться уже в цитозоле. Ясно, что опасность трансляции поврежденных или не полностью процессированных молекул мРНК (в результате чего получились бы усеченные, или по-другому — аберрантные, белки) столь велика, что клетка имеет несколько резервных мер, призванных предотвратить появление таких досадных случаев.

Дабы избежать трансляции разорванных молекул мРНК, машины инициации трансляции, прежде чем ее начать, опознают 5′-кэп и поли А-хвост (см. рис. 6.72). Комплекс соединения экзонов (EJC) до начала трансляции помогает подтвердить, что молекула мРНК должным образом сплайсирована: размещаясь на сплайсированной мРНК, он стимулирует ее трансляцию в белок (см. рис. 6.40).

Но самая мощная «система надзора» за мРНК, названная нонсенс-

опосредствованным распадом мРНК (nonsence-mediated mRNA decay), устраняет дефектные молекулы мРНК прежде, чем они могут быть транслированы в белок. Этот механизм вводится в игру, когда клетка решает, что молекула мРНК несет стоп-кодон (UAA, UAG или UGA) в «неподходящем» месте (такой кодон называют бессмысленным, или нонсенс-кодоном), — такая ситуация, вероятнее всего, возникает в молекуле мРНК, которая была неправильно сплайсирована. Аберрантный сплайсинг обычно приводит к случайному введению нонсенс-кодона в рамку считывания мРНК, особенно в организмах наподобие человека, чьи интроны отличаются большим средним размером (см. рис. 6.32, б).

Этот механизм надзора начинает действовать, когда молекула мРНК транспортируется из ядра в цитозоль. Как только 5′-конец мРНК показывается из ядерной поры, его встречает рибосома, которая и начинает транслировать эту мРНК. По мере протекания трансляции комплексы соединения экзонов (EJC), связанные с мРНК на каждом участке сплайсинга, очевидно, вытесняются движущейся рибосомой. Нормальный стоп-кодон будет находиться в пределах последнего экзона, так что ко времени, когда рибосома достигнет его и остановится, на мРНК больше не должно остаться ни одного EJC. Если дело обстоит именно так, то мРНК считается «прошедшей осмотр» и выпускается в цитозоль, где клетка может транслировать ее, уже не сомневаясь в ее правильности (рис. 6.80). Однако, если рибосома достигает преждевременного стоп-кодона и застопоривается, то это значит, что на молекуле

Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 595

заболевания обычно вызваны мутациями, которые нарушают функции ключевого белка — такого, как например, гемоглобин или один из факторов свертывания крови. Приблизительно одна треть всех генетических нарушений у людей обусловлена нонсенс-мутацией или мутациями (такими как мутации со сдвигом рамки считывания или мутации в участках сплайсинга), которые помещают нонсенс-мутации в рамку считывания гена. У индивидов, которые несут один мутантный и один функционально активный гены, нонсенс-опосредствованный распад устраняет аберрантные мРНК и таким образом предотвращает синтез потенциально токсичного белка. Без такой системы безопасности у индивидов с одним функционально активным и одним мутантным «геном патологии», по всей вероятности, симптомы заболевания были бы выражены намного сильнее.

Ранее мы уже узнали из этой главы, что бактерии не проводят сложной

«обработки» мРНК, т. е. процессинга, свойственного эукариотам, и что трансляция часто начинается до полного завершения синтеза молекулы РНК. И все же бактерии тоже имеют механизмы «проверки качества», призванные ре-

шать дальнейшую участь не полностью синтезированных и усеченных молекул мРНК. Когда бактериальная рибосома доходит до конца неполной РНК, она за-

стопоривается и не высвобождает РНК. Освобождение приходит в форме специальной РНК (названной tmРНК), кото-

рая входит в A-участок рибосомы и са-

мотранслируется, вызволяя рибосому. Специальная 11 аминокислотная метка

(тэг — от англ. tag), навешиваемая таким путем на C-конец усеченного белка, сигнализирует протеазам, что весь белок должен быть деградирован (рис. 6.81).

Рис. 6.81. Высвобождение бактериальной рибосомы, застопоренной на неполной молекуле мРНК.ПоказаннаяtmРНКпредставляетсобой363нуклеотиднуюРНК,обладающуюфункциямиитРНК, имРНК,откудаипроистекаетееназвание.Онанесет аланиниможетвойтивсвободныйA-участокзасто- поренной рибосомы, чтобы добавить этот аланин кполипептиднойцепи,подражаятРНК,хотянесуществует никакого кодона для организации этого шага.Тогдарибосоматранслируетеще10кодонов с tmРНК, завершая 11-членный аминокислотный «ярлык» на белке. Протеазы опознают эту метку и деградируют весь белок. Хотя представленный нарисункепримервзятизмирабактерий,эукариотытожемогутприбегатькподобнойстратегии.

Глава 6. Клеточные механизмы считывания генома: путь от ДНК к белку 597

домен появляется из рибосомы, в течение нескольких секунд он образует компактную структуру, которая содержит большинство конечных элементов вторичной структуры (α-спиралей и β-листов), выстроенных в близкой к правильной конформации (рис. 6.83). Для многих белковых доменов такое необычайно динамичное и пластичное состояние, называемое расплавленной глобулой (molten globule), служит отправной точкой для относительно медленного процесса, в ходе которого происходит множество видоизменений конформации боковых цепей, в результате которых в конечном счете формируется правильная третичная структура. На синтез белка среднего размера уходит несколько минут, и для некоторых белков бóльшая часть процесса фолдинга завершается к тому времени, когда рибосома высвобождает С-конец белка (рис. 6.84).

Рис.6.83.Структурарасплавленнойглобулы.а)Вформерасплавленнойглобулыцитохромb562 более открытименееупорядочен,чемвокончательносвернутойформе,изображеннойнавидеб.Обратите внимание,чторасплавленнаяглобуласодержитбóльшуючастьвторичнойструктурыконечнойформы, хотя концы α-спиралей еще не завиты, а одна из спиралей сформирована лишь частично. (Изображе-

ниялюбезнопредоставленыJoshuaWand,опубликованывY. Fengetal.,Nat.Struct.Biol.1:30–35,1994.

СвеликодушногоразрешенияиздательстваMacmillanPublishersLtd.)

6.2.18.  Сворачивание многих белков направляют молекулярные шапероны

Далеко не все белки начинают сворачиваться во время своего синтеза. Вместо этого, у выхода из рибосомы их встречают белки «специального назначения» —

класс белков, называемых молекулярными шаперонами (molecular chaperons).

Молекулярные шапероны нужны клеткам, потому что существует множество различных путей, которые могут быть выбраны для преобразования развернутого или частично свернутого белка в его конечную компактную конформацию. У многих белков некоторые из промежуточных продуктов, образующихся в ходе синтеза,