48. Борьба с вирусами с-х животных.

49. Лечение вирусных болезней.

50. ПЦР. Полимера́зная цепна́я реа́кция  (ПЦР)  — экспериментальный метод  молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Помимо  амплификации  ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение  мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для  клонирования  генов, выделения новых  генов. Компоненты реакции

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

• ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется  амплифицировать.

• Два  праймера,  комплементарные  противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.

• Термостабильная  ДНК-полимераза  —  фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов  —  Thermus aquaticus  (Taq-полимераза),Pyrococcus furiosus  (Pfu-полимераза),  Pyrococcus woesei  (Pwo-полимераза) и другие.

• Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты  (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

• Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.

• Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции  —  рН,  ионную силу раствора. Содержит соли,  бычий сывороточный альбумин.

ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и  вирусных  заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения  мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся  симптомы  заболевания

51. Принципы, техника и практическое значение ртга Настоящие методические указания преднаяначены для серо-

  логического контроля напряженности иммунитета к ньюкаслской бо-

  лезни (НБ), оценки эффективности иммунизации, определения опти-

  мальных сроков вакцинации (ревакцинации) птицы, а также для конт-

  роля эпизоотической ситуации по НБ в хозяйствах.

          1.2. Методика основана на обнаружении в сыворотке крови спе-

  цифических к вирусу НБ антигел (антигемагглютининов) в реакции

  торможения гемагглютинации.

          1.3. Сроки серологического обследования поголовья определены

  Наставлениями по применению вакцин против НБ и могут быть скор-

  рекитированы, исходя из эпизоотической ситуации в конкретном хо-

  зяйстве.

          1.4. Исследованию подлежат не менее 25 проб сывороток крови

  от птиц, взятых из различных мест птичника (зала) в объеме не ме-

  нее 0,5 см(3).

        1.5. Результаты каждого серологического исследования должны

  быть зарегистрированы в специальном журнале и проанализированы

  ветеринарным врачом хозяйства.

Для постановки РГА готовят двукратные разведения вакцинного

  вируса от 1:2 до 1:4096. С этой целью во все лунки одного ряда

  полистероловой микропанели микротитратором разливают физиологи-

  ческий раствор (0,05 или О,25 см3), в первую вносят в равном

  объеме вакцинный вирус трехкратно пипетируюти и переносят 0,05 или

  0,025 см3 во вторую лунку и т.д. Из последней лунки 0,05 или

  0,025 см3 удаляюти обезвреживают в 2%-ном растворе едкого натрия.

          После разведения вируса во все лунки вносят 0,7%-ную суспен-

  зию эритроцитов петуха в объеме, равном исходному объему физиоло-

  гического раствора. Микропанели аккуратно встряхивают и оставляют

  при команатной температуре (18-20*С). Учет реакции проводят после

  оседания эритроцитов в контроле.

          Для контроля эритроцитов на спонтанную гемагглютинацию оп-

  ределения времени учета реакции в две лунки с физиологическим

  растворам (0,05 или 0,025 см3) добавляют равный объем эритроцитов.

          РГА оценивают положительно при оcедании эритроцитов в виде

  хорошо выраженного "зонтика", отрицательно - в виде "пуговки". За

  титр вируса принимают его наибольшее разведение, дающее четко вы-

  раженную агглютинацию в виде "зонтика". Получение нечетких ре-

  зультатов может быть связано с изменившимся рН физиологического

  раствора.

52. РН Реакция нейтрализации основана на способности специфических вируснейтрализующих антител блокировать инфекционные, гемагглютинирующие, гемадсорбирующие, цитопатические, бляшкообразующие и др. свойства вирусов.Она применяется в двух направлениях:1) для идентификации вирусов;2) для серодиагностики вирусных инфекций, т.е. для определения нарастания титра вируснейтрализующих антител в «парных» сыворотках.Компоненты:1. Исследуемый вирус (при идентификации выделенною вируса) или исследуемая сыворотка (при серодиагностике инфекции).2. Диагностическая (группе-, видо-, типоспецифическая) сыворотка (при идентификации вируса) или известный вирус — диагностикум (при серодиагностике).3. Индикаторный объект: животные, куриные эмбрионы, культуры тканей или эритроциты.

Реакции нейтрализации т У!УО ставят в культурах клеток, куриных эмбрионах и на лабораторных животных.

Принцип. Смесью вирус (исследуемый или известный) + сыворотка (диагностическая или исследуемая), выдержанной в течение определенного времени, заражают культуру клеток, куриный эмбрион или лабораторное животное. При (+} реакции, т.е. при нейтрализации вируса антителами индикаторные объекты продолжают нормально существовать, а в контроле — гибель или характерные изменения.

Реакция нейтрализации — реакция торможения гемагглютинации (РТГА).

РТГА применяется:-для серотипирования вирусов;-для серодиагностики инфекций.Выделяют два способа постановки:- капельный способ на стекле (ориентировочная реакция), применяется для серо копирования вирусов;- развернутый в пробирках.

Механизм. У некоторых вирусов (например, гриппа) есть гемагглютинин, вызывающий агглютинацию эритроцитов различных животных, в зависимости от вида вируса. При наличии в сыворотке антител — антигемагглютининов наблюдаются инги-бирования активности вирусов.РТГА.Цель: серотипирование вируса гриппа А

Компоненты:1. Исследуемый материал — аллантоисная жидкость куриного эмбриона,2. Диагностические противогриппозные типоспецифиче-ские сыворотки,3. 5 % взвесь куриных эритроцитов.4. Физиологический раствор.

Реакция ставится на стекле капельным способом. На стекло наносят по 1 капле диагностических сывороток и исследуемого материала, перемешивают, затем добавляют 1 каплю взвеси эритроцитов. При положительной реакции наблюдается гомогенное покраснение, а при отрицательной выпадение хлопьев красного цвета (гемагглютинация).

54. РДП Принцип реакции диффузной преципитации (РДП) в агаре заключается в том, что одноименные специфические антиген и антитело, помещенные на определенном расстоянии друг от друга в агаровом геле, диффундируют и образуют при встрече друг с другом преципитат в виде белых полос. В случае несоответствия антигена и антитела полосы преципитации не появляются. Для воспроизводства феномена диффузной преципитации всегда необходимы следующие ингредиенты: антигены, сыворотки, агаровый гель.Методика постановки РДП в геле состоит в том, что в слое агарового геля делают несколько углублений (лунок) и в них наливают антигены и сыворотки, так, чтобы разные компоненты были в соседних лунках. Из лунок антигены и антисыворотки начинают диффундировать в слой геля. Реакция может быть поставлена в чашках Петри или на предметных стеклах во влажной камере. Предварительный учет результатов РДП производят через 8-10ч., основной- через 24ч. И окончательный- через 48-72ч. Высушить и окрасить, что позволяет их сохранять неопределенно долго и улучшает возможность фотографировать полосы преципитации.Данная реакция характеризуется простой техникой постановки, быстрым получением ответа, нетребовательностью к чистоте компонентов и стерильной работе, минимальной потребностью в компонентах, пригодностью для работы с любыми растворимыми антигенами и возможностью документирования результата путем фотографирования. К недостаткам следует отнести ее низкую чувствительность.

55. РИФ Реакция иммунофлюоресценции  (РИФ)  — это метод, с помощью которого можно выявить антитела к известным антигенам. Метод основан на микроскопии окрашенных специальным образом мазков и других образцов тканей. Применяется в основном для обнаружения возбудителей инфекций мочеполовых путей, таких как  хламидии,  микоплазмы,  трихомонады,  гонококки, вирус герпеса и пр.

Существует два типа реакции иммунофлюоресценции  — прямая и непрямая.

• Прямая иммунофлюоресценция (ПИФ)  — в этом случае непосредственно специфическое антитело мечено флюорохромом и реакция проходит в один этап, что значительно сокращает сроки исследования.

• Непрямая иммунофлюоресценция (РНИФ)  — в этом случае специфическое антитело не имеет метки, а для выявления комплекса антиген-антитело, образовавшегося на первом этапе, используют вторые меченые антитела, специфичные к конкретным антителам.

Материалом для исследования служат мазки. Техника взятия мазков не представляет опасности для здоровья и является безболезненной. Реакцию оценивают с помощью люминисцентного микроскопа. Если тестируемые возбудители присутствуют, то они светятся, как светлячки в объективе микроскопа.

56. ИФА Так же, как РИФ, иммуноферментный анализ проводится в прямом и непрямом вариантах, но, в отличие от нее, используется твердофазная модификация постановки ИФА в лунках полистироловых планшет (твердая фаза), в которых сорбируются (лат. sorbere - поглощать) антитела. При этом чаще используется непрямой вариант ИФА: 1) в лунки на 30 мин при температуре 37 °С вносится содержащий вирус материал; 2) к образовавшемуся имму но комплексу на 30 мин при той же температуре добавляют антивидовой пероксидазный иммуноконьюгат; 3) для выявления образования тройного иммунопероксидазного комплекса в лунки на 10 мин вносят ортофенилендиамин с Н202 как хромогенный субстрат для пероксидазы. Результаты твердофазной модификации ИФА, которые в положительных случаях проявляются пожелтением, учитываются с помощью специального спектрофотометра. РИА. Для проведения радиоиммунного анализа чаще всего используется конкурентный метод.

57. РСК Реакция связывания комплемента  (РСК)  за­ ключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммун­ ный комплекс, к которому через  Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комп­ лексом антиген—антитело. Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комп­ лемент остается свободным.  Специфическое взаимодействие АГ и  AT  сопровождается адсорб­ цией (связыванием) комплемента. Поскольку процесс связыва­ ния комплемента не проявляется визуально, Ж. Борде и О. Жангу предложили использовать в качестве индикатора гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка), кото­ рая показывает, фиксирован ли комплемент комплексом АГ-АТ. Если АГ и  AT  соответствуют друг другу, т. е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемоли­ за не происходит. ЕслиAT  не соответствует АГ, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой и вызывает гемолиз.Компоненты. Реакция связывания комплемента (РСК) относится к слож­ ным серологическим реакциям. Для ее проведения необходимы 5 ингредиентов, а именно: АГ,  AT  и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система).  Антигеном  для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, патологи­ чески измененных и нормальных органов, тканевых липидов, ви­ русы и вирусосодержащие материалы.В качестве  комплемента  используют свежую или сухую сыво­ ротку морской свинки.Механизм. РСК проводят в две фазы: 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (инди­ каторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемоли­ тической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содер­ жащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антите­ ло происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизирован­ ных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и ан­ титело не соответствуют друг другу (в иссле­ дуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — антиэритроцитарное антитело, вызывая гемо­ лиз; реакция отрицательная.  Применение. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифи­ лиса (реакция Вассермана).

58. Антитела и их роль в противовирусном иммунитете Нейтрализация вируса антителами препятствует прикреплению вируса к клетке и проникновению его внутрь (эффект усиливается в присутствии комплемента, кофактора и антиидиотипических антител, появляющихся на поздних стадиях инфекционного процесса) и связывают иммуноглобулиновые эпитопы иммунного комплекса, состоящего из вирусных частиц и антител. Иммунный комплекс связывается с Fc-рецептором макрофага с последующим его фагоцитозом и лизисом вируса. С помощью антител происходит опсонизация вируса, способствующая его фагоцитозу. Вируснейтрализующие антитела действуют непосредственно на вирус, находящийся во внеклеточном пространстве (при распространении из одной клетки в другую). Однако ряд вирусов (в том числе вирусы герпеса, ветряной оспы, цитомегалии) модифицируют антигены клеточных мембран и отпочковываются от них в виде инфекционных частиц, способных распространяться на соседние клетки, не встретившись с антителами (перемещаются по цитоплазматическим мостикам без контакта с циркулирующими антителами). В этом случае основную роль в защите играют клеточные механизмы, связанные с действием цитотоксических Т-лимфоцитов, Т-эффекторов и макрофагов. О преимущественном значении клеточного иммунитета при этих инфекциях свидетельствует тот факт, что дети с врожденным Т-клеточным иммунодефицитом не могут с ними справиться, а пациенты с дефицитом иммуноглобулинов, но с нормально функционирующей системой клеточного иммунитета, выздоравливают.