10

Виртуальная лаборатория пцр Виртуальное определение бактерий

Введение

Добро пожаловать в виртуальную лабораторию идентификации бактерий. Цель лаборатории ознакомить Вас с научными подходами и технологиями которые используются для определения различных видов бактерий основанных на очередности их ДНК.

Еще недавно определение очередности ДНК было нудным и занимающим много времени процессом. С появлением оборудования и инструментов это перестало быть рутиной. Методика используемая в этой лаборатории имеет различные применения, в том числе для научных исследований и судебных разбирательств.

Основные шаги:

• Возьмите пробу и выделите целую ДНК бактерии.

• Размножьте уникальные кусочки ДНК

• Разберите ДНК код

• Проанализируйте очередность цепочки ДНК и определите бактерию.

Кусочек ДНК который используется для идентификации бактерии эта та часть в которой закодирована маленькая единица подъединицы рибосомы РНК (16SрРНК). Мы рассмотрим эту часть как 16SрДНК. Различные виды бактерий имеют уникальные 16SрДНК – очередности. Определение основывается на сравнении очередности Вашей пробы и базы данных всех известных 16SрДНК очередностей. (Узнайте больше о рибосомальных РНК)

Рибосомальная рнк

Рибосомы – это органоид клетки в котором синтезируется белок. Они находятся в числе самых основных органоидов и находятся как у прокариот так и эукариотических организмов.

Цитоплазма прокариот содержит десятки тысяч свободных рибосом. Рибосомы состоят как из протеинов, так и из кусочков РНК. Рибосомы прокариот сообщает 70S (S=единица Сведберга, которая описывает количество осадка образующегоса в течении центрифугирования, которая зависит от размера, веса и формы частицы). 70S рибосомы состоят из двух частей - 50S и 30S – каждая часть содержит различный набор протеинов и моллекул рРНК. Менишая (30S) содержит 16S рРНК моллекул, а большая (50S) содержит 5S и 23S рРНК моллекул. Данная лаборатория описывает способ определения бактерий с помощью последовательности генома, который закодирован в 16S рРНК.

Определение целей:

• Какой Вид проб может использоваться для идентификации возможных патогенов?

• Что делает ПЦР, как она происходит, и почему она так полезна?

• Как можно выделить желательный ДНК из других?

• Как происходит автоматизирование ДНК очередности?

• Почему возможно использовать ДНК очередности для определения бактерий?

В процессе использования программы окно покажет информацию объясняющую Ваши действия. Все действия, тем не менее будут проводиться внутри графического окна слева. Маленький белый квадрат внизу графического окна будет давать особые инструкции какой объект следует выбрать.

Образец

Образцы, исследуемые в этой лаборатории были взяты из тканей и жидкостей, экстрактированных из увеличений лимфатических узлов пациентов, жалующихся на жар, усталость и увеличение ЛУ. Образцы были химически исследованы и посеяны на агаровую среду. Через несколько недель чашки Петри, в которых содержались четко различимые колонии бактерий были отправлены в лабораторию для идентификации специфических типов бактерий в пробе ПЦР и анализа ДНК очередности.

Эти страницы помогут Вам понять термины, оборудование и бактерии, которые встречаются в этой виртуальной лаборатории, чтобы найти:

1 – глоссарий

2 – Список инструментов лаборатории

3 – энциклопедия бактерий и других патогенов

16S рРНК, рибосомы -– это органеллы клеток, которые являются органами синтезирующими белки. Они включают в себя различные молекулы белка, которые ассоциируются с РНК молекулами (известные как рибосомальные РНК или рРНК). 16SрРНК один из трех РНК молекул, которая ассоциируется с рибосомами прокариот. 16Sобозначает их размер.

Аденин, Цитозин, Гуанин, Тимин - нитроген содержащие основы, являющиеся частью нуклеотидов ДНК, они часто обозначаются буквами А, Ц, Г, Т. Последовательность этих основ в молекуле ДНК составляетДНК код. Из-за структуры основы Аденин может образовывать две гидрогенные связи с Тимином, в то время как цитозин – три гидрогенные связи с Гуанином. А-Т и Ц-Г пары определяются дополнительно и наличие основ фундаментальнв для саморепликации ДНК.

Отжиг, расплавление, растаскивание - это три основных действия при проведении ПЦР. В контексте ПЦР отжиг относится к холодной фазе, которая продолжает фазу плавления, в течении фазы плавления двойная цепочка ДНК расщепляется. Во время отжига единичная цепь ДНК, которая комплиментарна, ведет к образованию новых пар ДНК (этот процесс называется гибридизация). В течение ПЦР вместо двух цепочек изначально идущих вместе первая молекула, которая представлена в более высокой концентрации чем ДНК соединяется с одинокой цепочкой ДНК, а во время фазы растаскивания ДНК-полимераза растягивает третью от первой, создавая копию ДНК.

BLAST(Основная локальная база данных исследования ) - это набор инструментов для сравнения информации о последовательности ДНК или белков с использованием всех доступных последовательностей имеющихся в базе данных.

Она разработана для того, чтобы найти пару в информации о последовательности с помощью поиска уникальных пар маленьких порций ДНК или белка, без использования большего количества материала. Эту информационную базу можно найти в национальной медицинской библиотеке.

ДНК-полимераза– это фермент, который точно копирует ДНК последовательность, с помощью полимеризации нуклеотидов, с целью образования ДНК, дополнительного для последовательности. Различные ДНК полимеразы отвечают за репликацию и образование новых пар ДНК. Полимеразы растягивают цепочку с помощью добавления нуклеотидов к третьему концу растущего ДНК.

ДНКиРНК - клеточные кислоты. ДНК состоит из двойных цепочек нуклеотидов. РНК обычно состоит из одной цепочки. ДНК/РНК полимезированные цепочки нуклеотидов. Полимеризация нуклеотидной цепочки происходит с помощью присоединения гидроксогруппы третьей карбоновой группе сахарозы к фосфату соседнего нуклеотида, таким образом на одном конце цепочки находится неприсоединенный гидрооксил или фосфат групп пятой карбоновой (5 – конец цепочки); на другом конце находится несоединенная группа третьей карбоновой (3 – конец цепочки).

Ген - сегмент ДНК, который кодирует функциональный продукт. Под функциональным продуктом понимается либо полипептид, либо РНК молекула. В более широком понимании ген может быть определен как единица наследственности которая передает информацию из одного поколения другому. В этом понимании ген также может включать сегменты ДНК, которые не содержат никакого кода, а скорее имеют специфические последовательности для построения других регулирующих молекул.

Нуклеотиды – составные компоненты ДНК и РНК. Каждый нуклеотид состоит из трех частей: нитрогенсодержащая база, 5-карбон сахарид и фосфатная группа. Основами являются аденин, цитозин, гуанин, тимин (ДНК) или Урацил (РНК).

ПЦР - полимеразноцепная реакция. Метод для создания большого количества копий уникальных частей ДНК. Использует версию ДНК полимераз, которые могут функционировать при высоких температурах вместе с автоматизированным прибором, который контролирует температуру – термостатом. Более подробно это описано в секции ПЦР нашей лаборатории.

Праймеры Олигонуклеотиды, которые были разработаны и произведены для соединения с уникальной часть известного сегмента ДНК. ДНК-полимераз могут растягивать олигонуклеотиды и дублировать ДНК. Процесс позволяет дублировать уникальные сегменты ДНК, например при связывании в ПЦР.

Supernatant - плавающая в пространстве или относящаяся к чистой жидкости поверх осадка. В этой лаборатории используется для описания слоя жидкости, который находится сверху центрифугированной материального вещества.

Термостат - врибор с инкубатором, хорошо удерживающим температуру, который может быть запрограммирован на очень быстрое и точное изменение температуры с повторением циклов. Инкубатор это металлический блок, в котором находится специальная форма для пробирок.

Автоматический ДНК секвенсер – автоматические ДНК-секвенсеры в основном представляют собой прибор для гелевого электрофореза сочетающегося с флуоресцентным детектором. Раньше модели использовали плоские традиционные гели с образцами повторяющимися на четырех дорожках. Таким образом каждая дорожк могла быть использована для определения одного уникального флуорисцентного показателя в соответствии с одим уникальным нуклеотидом. Более современны машины могли считывать все четыре нуклеотида одновременно. Модель которую использовали мы в лаборатории более совершенна. Она использовала клеточную трубу вместо плоского геля для электрофорезного движения; таким образом количество требуемых образцов гораздо меньше.

Буферный раствор - готовый, доступный реактив. Это генерализированный буферный раствор протеолитических энзимов разработанный для лизиса стенок бактериальных клеток и растворения состава клетки в жидкости. Другие протеины также перевариваются.

Микроконцентраторная колонна - это маленький инструмент в основном действует как искусственный микрофильтер. Микроконцентратор разделяет макромоллекулы основываясь на размере. Модель используемая в этой лаборатории сохраняет длину молекулы ДНК, в то время более мелкие молекулы, такие как нуклеотиды, праймеры и ДНК-полимеразы проходят сквозь фильтр. Отфильтрованые молекулы ДНК могут быть освобождены с помощью центрифуги в нижней части колонны.

ПЦР машина (амплификатор) - автоматическая ПЦР-машина стала более совершенной, легкой в использовании и широко доступной. Очевидно, что именно он привел к такому резкому развитию генетики в последние годы. Предписанное стандартом оборудование может дать отличные результаты (как было сделано в лаборатории), но исследователь может всегда изменить настройки (номер, температуру, продолжительность цикла и т.д.) в случае необходимости.

ПЦР смешиватель - колба для смешивания, которая содержит все необходимое для реакции репликации цепочки полимеразы до 16SРНК гена. Включает воду, буферная смесь для поддержания правильной рН среды для ПЦР реакции, большое количество нуклеотидов (Аденина, цитонина, гуанина и тианина), большое количество олигонуклеидов ДНК праймеров, которые расщепляют 16SрДНК необходимое для начала процесса репликации и термостабильную ДНК- полимеразу, которая растягивает копию цепоцки ДНК.

Пробирки Эпендорфа(микропробирки) - это удобно соединенные и цветозакодированные микроцентрифужные пробирки. Каждая пробирка разработана для содержания различных праймеров, а цвета соответствуют пямым или обратным направлениям репликации. (подробнее вIVразделе).

Пипетка - стандартная микропипетка, широкоиспользуется в современных биологических лабораториях.

HELP

Как пользоваться лабораторией

Интерфейс разделен на две основные части: Интерактивное окно слева и блокнот лаборатории справа, где и расположена данная страница. В то время как интерактивное окно будет подсказывать Вам с помощью текста в нижнем окне пурпурная стрелка укажет нам на предметы, которые необходимо взять (применить). Во время Вашей работы блокнот лаборатории автоматически будет снабжать Вас детализированной информацией о соответствующем шаге. Названные пункты находятся в нижнем окне и показывают соответствующий шаг (выделяются красным цветом). Вы можете перейти к любому шагу с помощью соответствующей ссылки, чтобы начать заново шаг нажмите на соответствующую ссылку. В любой момент Вы можете «кликнуть» полезные ссылки, которые тут же обновят информацию в блокноте лаборатории и покажет ссылки в глоссарий, инструменты используемые в лаборатории и энциклопедии бактерий и других патогенов. Кликнув «блокнот» Вы вернетесь к информации о соответствующем шаге.

Часть первая: Подготовка образцов

Ключ качественного определения начинается с успешной пробы. Многие патогенные бактерии не растут на плотных культуральных средах, поэтому определить пробу традиционными путями сложно. (Почему -> 1)

1) Ограничения в традиционных методах определения культур.

Десятилетиями ряд тестов развивался, с целью определить и охаректизовать различные виды бактерий. Тест включает посев и выращивание бактерий в различных условиях. Такие процедуры обычно требуют точного и надежного способа выращивания бактериальных культур. Многие патогены плохо растут на плотных культуральных среда, в то время как другие растут только в жидких культурах, поэтому определить вид патогена с помощью традиционных методов сложно или невозможно. С помощью молекулярного метода данные ограничения могут быть преодолены. Некоторые виды бактерий не могут быть дифференцированы от близких им видов с помощью традиционных методов. Для этих видов молекулярный метод предлагает единственный надежный и удобный способ определения.

Даже плохо растущие бактериальные культуры, могут быть определены с помощью метода применяемого в этой лаборатории. В этой лаборатории Вы будете превратитесь в патологиста или возможно сотрудника патологической лаборатории в хорошо оснащенной больницы.

Ваша задача определить бактериальные образцы полученные из клиники.

Для этого Вам нужно вырастить бактериальные колонии в плотной культуральной среде в чашке Петри, первый шаг вырастить единственную колонию и пересеять ее в микроцентрифужную пробирку. Процесс выделения бактериального ДНК состоит в расщеплении клеточной стенки с лизирующим раствором , находящимся в банке с белым колпачком, состоящим в наборе ПЦР. Буфер содержит протеолитические энзимы, которые «поедают» стенки клеток. Этот шаг может занять несколько часов. С Прежде чем приступить к использованию другого энзима в следующем шаге, нам нужно освободить пробу от протеолитических энзимов. Энзим денатурируемый с помощью нагревания образца в воде 100^оС. Дальше клеточная мембрана оседает при центрифугировании и представляет собой однородное включение в виде шарика внизу пробирки.

ДНК помещенное в supernatant, которая потом переливается в ПЦР пробирку.