Начало пцр

Все реакционные пробирки помещают в термоциклер (ПЦР машина), запускают автоматический процесс репликации ДНК (смотри анимацию). Машина используемая в этой лаборатории считывает и описывает происходящие события. (слева направо: температура, оставшееся время, номер цикла, растворение, отжиг, удлинение).

Температурный контроль настраивается последовательно: В первый шаг инкубации 95С – 10 минут.

30 последовательных шагов:

Расплавление – 95^оС – 30 секунд

Отжиг – 60^оС - 30 секунд

Достраивание – 72^оС – 45 секунд.

Последний шаг достраивания 72^оС 10 минут.

Последний шаг – 4^оС сохраняя эту температуру.

При каждом цикле, первый шаг (расплавление) разделение двойной цепочки ДНК, двойная ДНК спираль нагревается в пробирке с ПЦР реагентной смесью до 95^оС 30 секунд. Праймеры не могут прикреплятся к цепочке ДНК при такой высокой темперетуре поэтому пробирка охлаждается до 60^оС. При этой температуре праймеры прикрепляются (отжигают) один связанный кусок ДНК. (две обособленые части ДНК не могут восстановиться потому, что праймеров в растворе много больше, поэтому, более вероятно, что ДНК цепь присоеденится к праймеру вместо чего-либо другого). Последний шаг – (удлинение) позволяющий ДНК полимеразе достроить копию цепочки ДНК проходит при температуре 70^оС – 45 секунд.

Три шага – разделение цепочки, отжиг образцов праймеров и синтез новой цепочки – происходит менее чем за две минуты. Что происходит в каждой пробирке. В конце цикла каждый кусочек ДНК в пробиркаю будет отдуплецирован. Цикл можно повторить 30 и более раз и каждый новый синтезированный ДНК даст начало очередной цепи. После 30 циклов 1 миллион копий изначальной цепочки ДНК может быть сделан.

Часть iiiОчистка продуктов пцр

Пробирка быстро наполняется множеством копий 16SрДНК, всего около 1500 изначальных пар В это время разумно начать делать гель подтверждающий работу ПЦР реакции. Гель будет состоять из трех дорожек: первая – отрицательный контроль (то есть вода), которая не будет содержать продукта, при условии, что она не загрязнена; другой – положительный контроль (ПЦР продукт известной цепочки ДНК) для подтверждения, что реакция ПЦР выполнена; и последняя дорожка для исследуемой пробы. Если Вы уверенны, что ПЦР прошла успешно, то можете начинать процесс очистки продуктов ПЦР. Работа с гелем фактически является первым шагом к очистке. Когда ПЦР продукт в геле, вы можете вырезать соответствующие участки продукта ПЦР и изолировать ДНК из геля. В настоящее время Вы можете купить компактный микрофильтр отфильтровывающий ДНК из ПЦР пробирки без использования геля. В нашем опыте мы будем использовать такую микроконцентрационную колонну:

1. Возьмем микроконцентрационную колонну по размеру подходящую к пробирке.

2. Добавим 400 мкл буферного раствора в колонну.

3. Добавим чистое содержимое ПЦР (около 100 мкл) в колонну.

4. отцентрифугируем при скорости 3000 об./мин. На угловой центрифуге 15 минут.

5. ПЦР продукт останется в колонне, в то время как праймеры, нуклеотиды и прочие мелкие компоненты в которых нет необходимости сконцентрируются в пробирке.

6. перевернем колонну и прикрепим к новой концентрационной пробирке.

7. Добавим 50 мкл буферного раствора в перевернутую колонну. Этот шаг нужен для смыва ДНК из концентрационной колонны в пробирку.

8. Центрифугируем перевернутую колонну со скоростью 3000 об/мин. – 2 минуты. Для сбора образца в конценрационной пробирке. Извлекаем колонну.

В итоге концентрационная пробирка содержит множество кусочков от 1500 определенной длинны 16SрДНК с множеством мало значимый крупных цепочек ДНК (которые являются примесями).