Часть 4 Подготовка к распознаванию

Образец ДНК должен быть очищен; в Вашей ПЦР пробирке не должно быть почти ничего кроме 16SрДНК. Тогда мы можем начать подготовку образца к автоматическому распознаванию. Технология распознавания ДНК – новый шаг в молекулярной биологии впечатляющая точностью результатов. Это основной метод показывающий результат распознавания циклов ПЦР. (Вначале поговорим о цикле последовательностей)

Что такое повторение последовательности?

При построении, во время первого шага использования термоциклера, создается множество копий необходимого ДНК, но с одной неточностью: вы обрываете процесс репликации ДНК на неизвестной стадии копирования и потому копии всех частей построения различной длины. Реакционная смесь включает в себя нормальные диоксинуклеотиды (А, Ц, Г, Т) а также некоторое количество ддеоксинуклеотидов (А*, Ц*, Г*, Т*) которыми метят флуоресцентные маркеры. Флуоресцентные маркеры различаются для каждой основы и имеют определенное различное свечение (например: Г* - желтый, Т* - зеленый). Дидеоксинуклеотииды могут замещать нормальные диоксинуклеотиды во время репликации, но замещение происходит случайным образом и эта цепочка может не растянуться на длину отличную от цепочки ДНК. Такие дидеоксинуклеотиды называют терминаторами. (Смотри графическую картинку в анимации этой лаборатории).

Рассмотрим определенный пример. Построение шесть-базовой-длины определенной цепи ДНК (состоящей из последовательности 3` А-Ц-Г-Т-Т-Г 5`) в этой методике, Вы энергично начинаете размножать цепочку этой одной шести базовой длины. Так как ДНК полимераза разрывает копию ДНК от 5` конца до 3` конца (то есть от 5` конца до 3` конца этого образца ДНК) кусочки расходятся (помним, что А соответствует Т, а Ц соответствует Г)

Т*

Т-Г*

Т-Г-Ц*

Т-Г-Ц-А*

Т-Г-Ц-А-А*

Т-Г-Ц-А-А-С*

Во всех эти куски, последним (3` конца) основанием являются диденуклеотиды. Однажды сделав такие кусочки, вы можете разделять их основания на требуемую длину очень чувствительным способом гелевого электрофореза. Так как каждый отдельный размер цепи ограничена определенным основанием (для например Т-Г-Ц* заканчивается на Ц*), которое флуоресцирует определенным цветом. При рассмотрении цвета свечения ДНК цепочки определяется ее размер, вы можете регулировать построение для комплиментарного ДНК. (Т-Г-Ц-А-А-Ц), из которой вы можете определить оригинальную последовательность.

Т*

Т-Г*

Т-Г-Ц*

Т-Г-Ц-А*

Т-Г-Ц-А-А*

Т-Г-Ц-А-А-С*

Конечно, чтобы это работало репликация должна начаться с того же места на изучаемой ДНК. В вышеприведенном примере на учитываются такие кусочки как Г-Ц-А* (позиция 2-3-4), вращение по кругу. В добавок нормальный образец ДНК содержит двойные цепочки ДНК, которые могут проявлять себя не только как мы желаем (3` Т-Г-Ц-А-А-С 5`), но и комплиментарно (5` А-Ц-Г-Т-Т-Г 3`). Комплиментарные цепочки могут создавать такие куски как Г-Т-Т*, которые тоже нежелательны. Этих проблем надо остерегаться при использовании праймеров, что ограничивает специфическое определение последовательности одной цепочки. В нашем примере вместо шести оснований, рассматривается десять оснований цепи с четырьмя основаниями, от 3` конца фактической последовательности (3` Т-Г-Т-А-А-Ц-Г-Т-Т-Г 5`). Используются праймеры с последовательностью 3` А-Ц-А-Т, репликация всегда начинается в одном и том же месте и получается такой рост ДНК кусочка:

А-Ц-А-Т-Т*

А-Ц-А-Т-Т-Г*

А-Ц-А-Т-Т-Г-Ц*

А-Ц-А-Т-Т-Г-Ц-А*

А-Ц-А-Т-Т-Г-Ц-А-А*

А-Ц-А-Т-Т-Г-Ц-А-А-Г*

Данное слияние прерывается в конечной точке случайно, это затрудняет изготовление очень больших копий ДНК, также нежелательно делать очень короткие копии в этой реакции. В дальнейшем определяют длинные цепочки электрофорезом сложность которого в том, что он определяет только одно основание. Таким образом в последовательности длинных цепочек ДНК, используется много праймеров, каждый для своей реакционной пробирки. Данным путем перекрывается несколько секций параллельных последовательностей, результат компилируется и создается комплиментарная последовательность.

В этой лаборатории мы используем набор из 12 праймеров; семь для каждой цепочки от двойной цепи ДНК. Теоретически можно использовать один праймер в ПЦР определении последовательности, но это невыполнимо для длинных последовательностей. С множеством праймеров с короткими перекрытиями последовательности ДНК получают полную последовательность. В добавок нет абсолютной необходимости определения последовательности обеих цепочек, хотя упорядочивание обеих цепочек дает излишек информации, что снижает возможность ошибки. От точности нумерации и расположения праймеров используемых в реакции зависит их доступность и пригодность к использованию. Праймеры применяемые в данной лаборатории доступны в коммерческих источниках и связывают закрытые части 16SрДНК гена. Таким образом они определяют последовательность независимо от вида бактерии.

Все зеленые и голубые пробирки содержат последовательно смешанные буфер, праймеры (определенные для каждой пробирки), ДНК полимеразу, нуклеотиды и помеченные флуоресцентом метки-терминаторы в соответствующих пропорциях. Продукт ПЦР, полученный в прошлом шаге, добавляется в каждую из пробирок и ПЦР повторяют сначала. Целью этого является не получение тех же копий ДНК, но множества копий различной длины. Анимация иллюстрирует события происходящие в одной из пробирок содержащей праймеры 651R. Все ДНК цепочки связаны праймерами с одного конца и флуоресцированные метки терминаторы с другого конца.