Часть 5 Упорядочивание днк

После последнего шага у Вас имеется 12 пробирок содержащих конечный продукт ПЦР, смесь кусков ДНК различной длины. Все ДНК куски в каждой пробирке начинаются с идентичных праймеров, но заканчиваются с различными мечеными флуоресцирующими маркерами нуклеотидами (различного цвета для каждого нуклеотида А, Т, Г, Ц). Остатки заканчивающее разделение отдельных цепочек ДНК и определяющие конечные нуклеотиды. В заключение применяется автоматический анализатор для выполнения гелевого электрофореза ДНК из каждой пробирки. Гелевый электрофорез – метод молекулярного разделения основ в зависимости от их длины. Анализатор используемый в этой лаборатории состоит из тонких капиллярных пробирок прикрепленных к одному концу и нагнетающего механизма, который подает буферный раствор. Капилляры наполняются буферным раствором и противоположным концом вставляются в пробирки с кусочками ДНК. Затем подводят электрический ток, таким образом, что конец капилляра контактирующий с ДНК приобретает отрицательный заряд, а нагнетающий конец – положительный. После чего молекулы ДНК приобретающие отрицательный заряд начинают двигаться сквозь капилляры к положительно заряженному концу, при этом маленькие кусочки ДНК движутся быстрее чем большие. Ближе к нагнетающему конца капилляр проходит сквозь лазерное перекрытие, где возбуждаются флуоресцентные маркеры и оптический детектор считывает цвет флуоресцента.

Мы можем получить полный набор ДНК кусочков, все различия в размерах точно одного нуклеотида сгенерированного в прошлом шаге. Мельчайшие кусочки ДНК имеющие флуоресцирующую метку прикрепленную к этому праймеру. Эти фрагменты ДНК перемещаемые ускорителем. При считывании цвета (в нашем примере красного) мы выделяем какой нуклеотид следующий за праймером Тимин (Т). Следующий мелкий кусочек ДНК имеет зеленое свечение отображающий следующий нуклеотид в последовательности Аденин (А) и так далее (смотри анимацию). После прочтения последовательности базовых нуклеотидов по их свечению, всех кусочков ДНК лазерный барьер, последовательность ДНК может быть восстановлена. Автоматический анализатор перемещает пробирки в капиллярах к лотку и начинает электрофорез, повторяя программу до тех пор пока все 12 пробирок не будут исследованы. После определения последовательности проверяют на компьютерной программе на совпадение с последовательностью с 16SрДНК гена.

Часть 6 Анализ последовательности днк.

После считывания информации все реакционные пробирки извлекаются, компьютер составляет действительную последовательность сопоставляя разрозненные куски. Теперь у Вас есть 16SрДНК последовательность этого вида бактерии которую можно сравнить со всеми другими известными 16SрДНК последовательностями для идентификации.

Все множество последовательностей хранится в действительной базе данных. Эта база данных является коммерческой и оплачивается как часть идентификационного оборудования. В этом примере мы будем использовать ГенБанк общественной базы данных входящий в состав Национальной Медицинской библиотеки. Множество последовательностей известно как BLAST(Основная локальная база поиска инструмента). Огромное множество ДНК последовательностей помогает точно определить искомый вид бактерии. Если из множества последовательностей Вы не обнаружили искомую, то это либо новый вид, либо вариации существующего.

Нажмите продолжить для начала процесса определения.

Ниже результаты данной ДНК последовательности. Эти данные надо скопировать и поместить в имитатор BLASTпоисковой страницы.

Нажмите кнопку «Copy» для выделения и копирования данных.

Нажмите кнопку «BLAST» для продолжения работы с имитатором поисковой страницы.