диссертации / 131

2.2Методы исследования

2.2.1Гистологическое исследование

При макроскопическом исследовании удаленного операционного материала оценивали локализацию и размеры опухоли поджелудочной железы, ее консистенцию, наличие очагов распада и кровоизлияний. Так же отмечали прорастание опухоли в парапанкреатическую клетчатку, в

прилежащие структуры - стенку желудка и двенадцатиперстной кишки в случае локализации опухоли в головке поджелудочной железы, в селезенку при опухолях тела и хвоста, оценивали возможность прорастания опухоли в стенки висцеральных сосудов (чревного ствола, верхней брыжеечной артерии, воротной вены). Все информативные фрагменты опухоли, а так же найденные регионарные лимфатические узлы брались для гистологического исследования.

Материал фиксировали в 10% растворе забуференного нейтрального формалина (pH 7.0-7.2), затем кусочки заливали в парафин по обычной методике. С парафиновых блоков изготавливали серийные срезы толщиной 3

-5 мкм, депарафинировали по стандартной схеме, затем окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологические препараты изучали и фотографировали с помощью обычного светового микроскопа Leica DMLB,

а так же с помощью системы сканирования гистологических срезов 3D Histech и программы Panoramic Viewer, с целью уточнения соотношения различных типов гистологических структур в опухоли.

2.2.2 Иммуногистохимическое исследование

Иммуногистохимическое исследование с целью изучения

пролиферативной и апоптотической активности опухоли, проводили на

иммуногистохимического исследования использовали маркер пролиферации опухолевых клеток Ki67 (клон MIB-1) и маркер мутаций регуляторного гена p53 (Clone 318-6-11) фирмы DAKO.

Кусочки тканей для иммуногистохимического исследования фиксировали в 10% забуференном формалине (pH - 7.2), затем заливали в парафин по стандартной методике. Серийные парафиновые срезы толщиной

2-3 мкм наносили на стекла с адгезивным покрытием, депарафинировали по стандартному протоколу. Постановку иммуногистохимических реакций проводили с использованием стандартных протоколов, прилагаемых к используемым антителам. Высокотемпературную обработку срезов проводили в растворе цитратного буфера pH 6,2 , нагревая его на водяной бане до 95-98oС в течение 20 минут, с последующим охлаждением до комнатной температуры.

Визуализацию результатов иммуногистохимического исследования проводили с помощью системы (Ultra Vision LP) LabVision, c

использованием диаминбензидина (DAB), ядра докрашивали гематокистином. Положительно окрашенными считали темно коричневые ядра, тогда как не окрашенные ядра имели синий цвет. Результаты реакции оценивали в процентах окрашенных ядер опухолевых клеток относительно не окрашенных на 100-300 клеток.

2.2.3 Метод TUNEL

Изучение процессов апоптоза в опухоли проводили с помощью системы детекции апоптоза DeadEnd Colorimetric TUNEL System. TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) - представляет собой аналитическую систему, которая позволяет выявить фрагментированные молекулы ДНК на поздних стадиях апоптоза или программированной гибели клетки. Метод основан на использовании

42

фермента терминальной деоксинуклеотидил трансферазы (TdT), который распознает точки фрагментации в молекуле ДНК. Исследованию подвергали серийные срезы с парафиновых блоков, приготовленных по стандартной методике. Депарафинацию срезов проводили в ксилоле, затем проводили через спирты нисходящей крепости до дистиллированной воды. Постановку реакции осуществляли по стандартному протоколу, рекомендованному производителем. После этапа депарафинации срезы опускали в 0,9% раствор

NaCl на 5 минут. Затем, после промывки в фосфатном буфере, срезы фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 15 минут.

Восстановление молекул проводили с помощью раствора протеиназы К 1:500

в течение 20 минут, после чего проводили повторную фиксацию в 10%

забуференном формалине и обрабатывали срезы в течение 10 минут в уравновешивающем буфере. Затем на срезы наносилась смесь реагентов,

которая включала раствор терминальной деоксинуклеотидил трансферазы

(TdT), биотин-нуклеотидную смесь и уравновешивающий буфер в пропорциях, рекомендованных производителем (Рис.12).

Рис.12 Состав смеси реактивов для системы TUNEL

Инкубация со смесью реагентов проводилась в течение 60 минут при температуре 370С, срезы накрывались покровными стеклами. После окончания реакции срезы промывались последовательно в дистиллированной

43

воде, фосфатном буфере, обрабатывались 0,3% H2O2 и в растворе стрептавидина HPR. На конечном этапе срезы обрабатывались раствором диаминбензидина (DAB Cromogen) в течение 1-2 мин, до появления светло коричневого фона, опускались в раствор гематоксилина и заключались под покровное стекло. В качестве отрицательного контроля реакции на этапе инкубации со смесью реагентов из раствора исключался TdT. В качестве положительного контроля использовалась обработка срезов раствором фермента ДНКазы (DNase, производитель Qiagen, Германия) в рабочей концентрации 3 е.а. в мкл, которая проводилась перед этапом нанесения смеси, содержащей TdT. Результаты реакции учитывались путем подсчета абсолютного количества ядер клеток с коричневым окрашиванием во всем срезе.

2.2.4 Электронно-микроскопическое исследование

Для электронно-микроскопического исследования 7-8 кусочков опухоли,

полученной от 10 больных с ПАК ПЖ размером приблизительно 1 мм3,

фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида и 1% растворе четырехокиси осмия.

Затем материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации

(50, 70, 96 и 100%), после чего пропитывали в смеси окись пропилена-

аралдитовая смола. После пропитки материал помещали в капсулы и заливали аралдитовой смолой, затем помещали в термостат при температуре

60оС на двое суток. Из полученных блоков готовили полутонкие срезы толщиной 1,5-2 мкм. После этого срезы окрашивали толуидиновым синим.

После предварительного светомикроскопического исследования полутонких срезов вырезали пирамидки с таким расчетом, чтобы поверхность среза приходилась на интересующий нас участок. Ультратонкие срезы толщиной

100-200 нм получали на ультрамикротоме фирмы LKB (Швеция).

44

Ультраструктурное изучение препаратов проводили при помощи электронного микроскопа JEOL JEM 100-CX (Япония) в трансмиссионном режиме при ускоряющем напряжении 80КВ [21].

2.2.5 Анализ выживаемости

Данные общей выживаемость пациентов собирались прямым методом,

с помощью опроса и анкетирования больных.

Статистическая обработка полученных данных проводилась программой Statistica 6.0 (StatSoft, USA), значимым считали значения коэффициента p≤0.05. Выживаемость оценивалась методом Каплана Майера

(1958), преимуществом которого является возможность оценивать не только полные данные, но и цензурированные, а так же проводить сравнительный анализ выживаемости в различных группах больных.

Полные данные по выживаемости были получены от 32 больных, к

цензурированным данным отнесены 15 пациентов, из которых 10 были живы на момент исследования, а судьба 5 пациентов прослежена на протяжении 7, 12, 15 и 41 месяцев.

В программе Statistica 6.0 данные помещались в таблицу, в строках которой размещались пациенты, а в столбцах соответствующие им клинические и морфологические характеристики, а так же указывался тип данных (CENSURED/COMPLETE) [20].

45

Глава III. Результаты собственных исследований и их обсуждение

Удаленная опухоль поджелудочной железы представляла собой образование серовато-желтоватого цвета, диаметром от 2 до 7 см, без четких

границ.

В большинстве случаев макроскопически определялся рост в парапанкреатическую клетчатку и стенку двенадцатиперстной кишки (pT3

стадия опухоли).

В случае локализации опухоли в области головки поджелудочной железы часто наблюдалось сдавление общего желчного и главного

панкреатического протоков, за счет прорастания их стенок опухолю,

ретенционное расширение проксимальной части холедоха и панкреатических протоков в области тела и хвоста поджелудочной железы (Рис 13).

В 3х случаях наблюдалось прорастание стенки верхней брыжеечной артерии (pT4). При локализации опухоли в дистальной части поджелудочной железы определялось прорастание в область ворот селезенки (Рис 14).

Ткань опухоли во всех случаях была очень плотной консистенции, без участков распада и кровоизлияний.

Иногда присутствовали мелкие кисты диаметром 0,1- 1 см,

заполненные слизистым содержимым.

В случаях локализации опухоли в головке ПЖ, маркировка макропрепарата производилась в соответствии с рекомендациями CAP (College of American Pathology, 2013), производилась оценка среза поджелудочной железы, среза общего желчного протока, маркировались задняя, передняя и медиальные поверхности парапанкреатической клетчатки

(Рис. 15).

Затем через препарат проводили параллельные поперечные срезы,

захватывающие опухоль, парапанкреатическую клетчатку и область ампулы

(Рис. 16).

46

Рис.13 Протоковая аденокарцинома головки поджелудочной железы

Резецированный комплекс в составе двенадцатиперстной кишки, головки и тела поджелудочной железы. Опухоль прорастает стенку кишки, главный панкреатический проток и общий желчный проток. В области тела поджелудочной железы - ретенционное расширение протоков.

Рис.14 Протоковая аденокарцинома хвоста поджелудочной железы.

Прорастание опухоли в область ворот селезенки.

47

Рис.15 Схема маркировки панкреато-дуоденального комплекса.

Рис 16. Параллельные срезы ткани поджелудочной железы с опухолью.

Цветом маркированы различные поверхности парапанкреатической клетчатки.

48

В случае локализации опухоли в дистальных отделах поджелудочной железы, цветом маркировались 2 поверхности парапанкреатической клетчатки.

При микроскопическом исследовании ПАК ПЖ имела гетерогенную структуру - в одном и том же срезе опухоли в различных соотношениях определялись железистые структуры различной степени дифференцировки,

иногда участки слизеобразования.

Строма опухоли хорошо развита, десмопластическая, иногда с признаками инфильтрации лимфоцитами, плазмоцитами и макрофагами.

Характерной особенностью протоковой аденокарциномы было наличие инвазии периневральных пространств в парапанкреатической клетчатки,

которая наблюдалась в большинстве исследованных случаев (85%) (Рис.17),

внутрисосудистая микроинвазия имелась в 4 исследованных случаях (8,5%).

Рис.17 Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы. Опухолевая инвазия периневральных пространств парапанкреатической клетчатки.

Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х25.

49

Задачами гистологического исследования рака поджелудочной железы,

согласно рекомендациям ВОЗ (2010) и международным протоколам САP

(2012), являются определение гистологического типа опухоли, стадии TNM (UICC,2010), исследование хирургических краев резекции для определения

R-статуса, выявление сосудистой и периневральной инвазии и определение степени злокачественности опухоли (grade).

3.1 Оценка степени злокачественности ПАК ПЖ с помощью системы градации, рекомендованной ВОЗ

На первом этапе исследования оценка степени злокачественности ПАК ПЖ проводилась по системе, рекомендованной ВОЗ [39], согласно которой grade опухоли определяется аналогично степени ее гистологической дифференцировки (Таблица 5).