диссертации / 122

31

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Общая клиническая характеристика больных

Обследовано 993 пациента с достоверным диагнозом РА, в том числе

102 – с ранней стадией РА (длительность заболевания < 6 месяцев) и 891- с

развернутой стадией РА (длительность заболевания > 6 месяцев),

наблюдавшихся в ФГБНУ НИИР им.В.А.Насоновой в период с 2010 по 2012

год. Диагноз РА основывался на классификационных критериях АCR 1987 г.

и ACR/EULAR 2010 г.[18,22] (табл.6). Среди пациентов с ранним РА преобладали IgM РФ- (66,7, p=0,0001), АЦЦП- (57%, p=0,047) и АКА- (62,5, p=0,02) позитивные больные с II рентгенологической стадией (72%, p=0,0001), I функциональным классом (73,5%, p=0,0001), низкой активностью заболевания по DAS28 (75,5%, p=0,0001). Все больные получали различные базисные противовоспалительные препараты (БПВП) и

глюкокортикоиды (ГК). Основную часть пациентов с РА составляли лица женского пола, среднего возраста, серопозитивные по IgM РФ (67%, p=0,0001), АЦЦП (73%, p=0,0001), АМЦВ (85%, p=0,0001), с II

функциональным классом заболевания (65%, p=0,0001), получавшие различные БПВП и ГК. Внесуставные проявления (ревматоидные узелки,

васкулит, полинейропатия, синдром Шегрена, генерализованная амиотрофия,

анемия, поражение глаз, конституциональные изменения - снижение веса,

лихорадка) наблюдались у 16% больных РА. Группу сравнения (n=616)

составили: 27 пациентов с системной красной волчанкой (СКВ), 15 - с

синдромом Шегрена (СШ), 25 - с анкилозирующим спондилоартритом (АС), 33 - с остеоартритом (ОА), 20 - с OVERLAP синдромом, 9 - с подагрическим артритом (ПА), 22 - с псориатическим артритом (ПCА), 168 - с

недифференцированным артритом (НА) и 297 здоровых доноров,

сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными (табл.6).

32

33

Продолжение табл. 6.

2.2. Методы исследования

Всем больным проводилось полное клиническое, лабораторное и инструментальное обследование с использованием стандартных методов,

применяемых в ФГБНУ НИИР им. В.А.Насоновой”.

Клиническое исследование суставов включало стандартные методы подсчета числа болезненных и припухших суставов [11]. Для количественной оценки активности РА использовался модифицированный индекс DAS28 (Disease Activity Score 28) [160], основанный на подсчете числа болезненных

(ЧБС) и припухших (ЧПС) суставов из 28 (плечевые, локтевые,

лучезапястные, 1-5 пястно-фаланговые, 2-5 проксимальные межфаланговые и коленные), общей оценке состояния здоровья пациентом (ОСЗП) по 100-

миллиметровой визуальной аналоговой шкале (ВАШ) и определении СОЭ.

Вычисление DAS28 проводилось в баллах (от 0 до 9,4) по формуле: DAS28=0,56 ЧБС28+0,28 ЧПС28+0,70 ln(СОЭ)+0,014 ОСЗП.

Активность болезни классифицировалась следующим образом: ремиссия

34

(DAS28 ≤2,6), низкая (2,6<DAS28 ≤3,2), средняя (3,2<DAS28 ≤5,1), высокая

(>5,1).Функциональный статус пациентов оценивался по Стэнфордскому опроснику состояния здоровья HAQ (Health Assessment Questionnaire) [81].

Рентгенография суставов проводилась в рентгенологическом отделении ФГБНУ НИИР им. В.А.Насоновой (руководитель д.м.н. Смирнов А.В.). Рентгенологическую стадию РА устанавливали по классификации Стейнброкера (1949г) [199]. Для подсчета эрозий и оценки сужения суставных щелей в суставах кистей и дистальных отделов стоп использовали метод Шарпа в модификации van der Heijde [6,223].

Иммунологические исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии и молекулярной биологии ревматических заболеваний ФГБНУ НИИР им. В.А.Насоновой (руководитель – д.м.н.

Александрова Е.Н.).

Кровь из локтевой вены в количестве 9 мл собирали в вакуумную пробирку S-Monovette («Sarstedt», Германия) с добавлением геля для активации свертывания крови. Пробирку с кровью оставляли на 30 минут при комнатной температуре в вертикальном положении для образования сгустка, затем центрифугировали 15 минут при 1100 – 1300 g с охлаждением до 40С. После центрифугирования сыворотку крови собирали, перемешивали и аликвотировали по 0,3 мл в микропробирки типа “эппендорф”. Все образцы исследуемого биологического материала хранили при -700С. Интервал между процедурой взятия крови и замораживанием образцов сывороток составлял не более 30 минут.

2.2.1. Методика определения IgM РФ

Концентрацию IgM РФ в сыворотке крови измеряли

иммунонефелометрическим методом с латексным усилением на анализаторе

BN ProSpec (“Siemens”, ФРГ) с использованием реагентов N Latex RF Kit

35

(“Siemens”, ФРГ). Чувствительность определения IgМ РФ равнялась 9,5

МЕ/мл. (рис.5). Верхняя граница нормы составляла 15 МЕ/мл.

Рисунок 5. Калибровочная кривая для определения IgM РФ методом иммунонефелометрии.

2.2.2. Методика определения IgA РФ

Количественное определение IgA РФ в СК проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов Rheumatoid Factor IgA (“ORGENTEC Diagnostika”, ФРГ) согласно инструкции фирмы-изготовителя.

Чувствительность определения IgA РФ равнялась 0,1 ЕД/мл. Верхняя граница нормы составляла 20 ЕД/мл (рис.6).

.

Рисунок 6. Калибровочная кривая для определения IgA РФ методом ИФА.

2.2.3. Методы определения АЦЦП

Иммуноферментный анализ

36

Количественное определение АЦЦП в сыворотке крови проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов Anti-CCP (“Axis-Shield”, Великобритания) согласно инструкции фирмы-изготовителя.

Чувствительность ИФМ определения АЦЦП равнялась 0,1 ЕД/мл (рис.7).

Верхняя граница нормы составляла 5 ЕД/мл.

Рисунок 7. Калибровочная кривая для определения АЦЦП методом ИФА.

Электрохемилюминесцентный анализ Сывороточную концентрацию АЦЦП измеряли ЭХЛ – методом на

автоматическом анализаторе “Cobas e 411” (“Roche” Швейцария).

Чувствительность ЭХЛ определения AЦЦП равнялась 7 ЕД/мл. Верхняя граница нормы по данным производителя - 17 Ед/мл. Исследование АЦЦП с помощью метода ЭХЛ использовалось для сравнения диагностической ценности различных методов определения АЦБ.

Иммунохроматографический анализ Качественное определение АЦЦП методом сухой хроматографии на

основе коллоидного золота проводили c использованием сухих тест-полосок

“CCPoint” фирмы “Euro-Diagnostica” (Швеция) согласно инструкции фирмы-

изготовителя. Исследование АЦЦП с помощью метода ИХА использовалось для сравнения диагностической ценности различных методов определения АЦБ.

2.2.4. Методика определения АМЦВ

37

Количественное определение АМЦВ в сыворотке крови проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов “AntiMCV” (“ORGENTEC Diagnostika”, ФРГ) согласно инструкции фирмы-

изготовителя. Чувствительность ИФМ определения AМЦВ равнялась 0,1

ЕД/мл. Верхняя граница нормы составляла 20 ЕД/мл (рис.8). ИФА АМЦВ использовался в качестве основного метода определения АМЦВ для выполнения целей и задач диссертационной работы.

Рисунок 8.Калибровочная кривая для определения АМЦВ методом ИФА.

Иммунохроматографический метод.

Качественное определение АМЦВ методом сухой хроматографии на основе коллоидного золота проводили c использованием сухих тест-полосок

“Rheumachek” фирмы “Orgentec” (ФРГ) согласно инструкции фирмы-

изготовителя. Исследование АМЦВ с помощью метода ИХА использовалось для сравнения диагностической ценности различных методов определения АЦБ.

2.2.5. Методика определения АКА

Качественное определение АКА в сыворотке крови проводилось методом непрямой иммунофлюоресценции (НРИФ) с использованием коммерческого набора реагентов Immuno Glo, Anti-Keratin Antibody IFA (“IMMCO Diagnostics”, США) согласно инструкции фирмы-изготовителя.

38

Результаты считались положительными при наличии свечения АКА в титре

1:10 (рис.9).

Рисунок 9. АКА при определении методом НРИФ

2.2.6. Методы оценки клинической информативности определения АЦБ

Оценка клинической информативности определения биомаркеров РА осуществлялась путем расчета операционных характеристик теста:

диагностической чувствительности (ДЧ), диагностической специфичности

(ДС), отношения правдоподобия положительного и отрицательного результатов (ОППР и ОПОР) (табл. 7) [15].

Таблица 7. Параметры оценки диагностической точности лабораторного теста

39

Согласно рекомендациям ACR наиболее полезными для диагностики РА считались лабораторные тесты с ОППР>5 и ОПОР<0,2; полезными – с

ОППР>2 и ≤5, ОПОР>0,2 и ≤0,5; не имеющими пользы - с ОППР≤2 и

ОПОР>0,5 [94]. Для анализа диагностической эффективности (ДЭ)

лабораторных тестов использовалась также характеристическая кривая

(ROC-кривая), отражающая зависимость частоты истинно положительных результатов (чувствительность) от частоты ложноположительных результатов (1-специфичность). Диагностическая ценность лабораторного теста определялась тем, насколько высоко лежит его ROC-кривая. Для оценки ROC-кривых вычислялась площадь под кривой (AUC), варьирующая от 0,5 (отсутствие диагностической эффективности теста) до 1,0 (максимальная эффективность теста) [257].

2.2.7. Методы статистической обработки результатов исследования

Обработка результатов включала общепринятые методы параметрического и непараметрического анализа. Для описания распределения анализируемых показателей рассчитывали частоты встречаемости для дискретных переменных или параметры для непрерывных, используя стандартное представление M±m, где M – среднее арифметическое, а m – статистическая погрешность его определения

(среднеквадратичное отклонение среднего по группе) [4], а также другие параметры, включая процентили. Для поверки корректности использования методов параметрической статистики анализировали формы распределения переменных. В случае их некомпактности (с целью исключения погрешностей при расчете достоверности различий средних по группам)

использовали аналогичные методы непараметрической статистики, т.е.

проводили сравнение не исходных значений переменных, а их рангов.

При сравнении параметров с нормальным распределением применялся парный t-тест для независимых выборок. Для параметров, распределение

использовали критерий Манна-Уитни, а при сравнении трех и более групп – критерий Краскела-Уоллеса, результаты представлены в виде медианы (Ме) с

интерквартильным размахом (ИР, 25-й - 75-й процентили). Для измерения

степени согласованности результатов определения АЦБ различными

методами/тест-системами использовался коэффициент каппа (æ) Коэна [57].

Корреляционный анализ проводился по методу Спирмена. Различия считались достоверными при p<0,05.

Прогноз значений одной переменной по другим проводили при помощи метода многомерной линейной регрессии (многофакторного

анализа), при котором прогноз показателя по показателям 1… n

n

осуществляется в виде прогноз с bk k . Коэффициенты bk в приведенных

k 1

таблицах называются нестандартизованными коэффициентами. Для сравнительного анализа вклада факторов в прогностическую модель приведены также таблицы стандартизованных коэффициентов k,

отличия от нуля. Клиническую значимость полученного прогностического правила определяли при помощи построения ROC-кривой.