диссертации / 122

тирозинфосфатазы (PTPN22) [75,205].

Kератины – фибриллярные белки, молекулярной массой 44-66 кДа,

образующие в эпителиальных клетках промежуточные филаменты.

Некоторые из этих белков принимают участие в процессах апоптоза и передачи внутриклеточных сигналов (рис.4) [174].

Рисунок 4. Структурная модель кератина.

Примечание: N - неспиральный головной домен; С - неспиральный хвостовой

домен; 1А, 1В, 2А, 2В - спиральные сегменты.

Непосредственной мишенью для АКА является белок филаггрин (40

кДа) - гидрофильный белок, аггрегирующий филаменты кератина [183].

Филаггрин образуется в результате протеолитического процессинга белка профилаггрина — главного компонента кератогиалиновых гранул кератиноцитов. Известно 42 варианта аминокислотных последовательностей этого белка (ZVSTHEQSESAHGR, HQGSSVSQDSDSER, WSGSASR, HSGIGHGOASSAVR и др.). Молекулы филаггрина фосфорилируются и часть его аргининовых остатков под действием ПАД превращается в цитруллин [82,85,113,180].

1.3.2. Методы определения антител к цитруллинированным белкам при ревматоидном артрите

Исследование АЦБ началось в 1964 г. с разработки R. Nienhuis и E. Mandema метода непрямой иммунофлюоресценции (НРИФ) для определения в сыворотках больных РА АПФ – антител, реагирующих с

22

кератогиалиновыми гранулами клеток эпителия слизистой оболочки щеки человека. АПФ, ДЧ которого составляла 40-91%, а ДС - 73-99% [12,103,145],

присутствовал как в сыворотке, так и в синовиальной жидкости больных РА

[136]. Через 15 лет были обнаружены АКА, реагирующие с эпителием пищевода крысы, и установлена их высокая специфичность (95-97%) при РА

[250]. Во всех исследованиях отмечалась связь между позитивностью по АПФ и АКА с тяжестью заболевания и выраженностью деструкции суставов

[83]. Несмотря на высокую специфичность этих маркеров для диагностики РА, они не нашли широкого применения в клинической лабораторной практике из-за технических трудностей, связанных со стандартизацией субстрата и субъективизмом оценки результатов иммунофлюоресцентного теста. В 1993 г. было установлено, что мишенью для АКА в эпителии человека является белок филаггрин, и разработано определение антител к нему с помощью иммуноблотинга и ИФА. В качестве субстрата использовался очищенный филаггрин, выделенный из эпителиальной ткани человека [155,184,235]. Недостатком тестирования АФА является сложность получения его стандартизованных высокоочищенных препаратов. В 1998 г. Shellekens и соавт. обнаружили, что антигеном для всех перечисленных выше аутоантител является атипичная аминокислота цитруллин, а в 2000 г. был создан набор для определения АЦЦП IgG изотипа методом ИФА первого поколения (АЦЦП1) [180,181].

Среди существующих методов определения АЦБ наиболее распространенным является иммуноферментный анализ (ИФА) с

использованием в качестве антигена ЦЦП2. Выявление АЦБ методом иммуноэлектрофореза обладает высокой ДС (95%) и умеренной ДЧ (20-75%)

при РА, но в связи с трудоемкостью методики не применяется в рутинной лабораторной практике [67,76,92,98,106]. Вместе с тем, определение АЦБ методом ИФА пока еще недостаточно стандартизовано, что приводит к низкой межлабораторной сопоставимости результатов (табл.3) [16]. Различия в клинической информативности тест-систем для ИФА АЦБ связаны с

23

особенностями используемых реагентов, антигенов и выбранных производителями значений верхней границы нормы (ВГН). В последние годы в лабораторной практике применяются и такие новые методы определения АЦБ, как электрохемилюминесценция (ЭХЛ) и иммунохроматографический анализ (ИХА), однако их диагностическая ценность при РА еще мало изучена

(табл.4) [16,37,246].

Таблица 3.

Корреляция* результатов, полученных с использованием различных тестсистем для определения АЦЦП

Примечание:* - коэффициент корреляции Спирмена (p<0,05 во всех случаях),

ИНМ - иммунонефелометрия

Таблица 4.

Характеристика тест-систем, использующихся для определения АЦБ (по данным производителей)

24

Продолжение табл.4.

Примечание: ФИА - флюоресцентный иммуноферментный анализ, ХЛ – хемилюминесценция.

1.3.3. Клиническое значение антител к цитруллинированным белкам при ревматоидном артрите

Принципиально новым направлением лечения РА стала концепция ранней агрессивной терапии, в основе которой лежат данные о том, что наиболее высокая степень деструкции суставов, определяющая неблагоприятный прогноз болезни, наблюдается именно в дебюте заболевания [7]. Однако, учитывая недостаточную специфичность клинических признаков и низкую чувствительность установленных клинико-

лабораторных критериев заболевания, диагностика РА на начальных стадиях представляет достаточно сложную задачу [111].

25

На сегодняшний день накоплено достаточное количество данных,

позволяющих считать АЦЦП наиболее эффективным диагностическим маркером РА. Разработка ИФА с использованием в качестве антигена ЦЦП2

позволила достигнуть ДЧ ≈91% и ДС ≈98% (ПЦПР - 87,5%; ПЦОР - 86,5%) [26,122].

Высокий диагностический потенциал АЦЦП2 подтверждается их выявлением у 34-69,3% серонегативных по IgM РФ пациентов с РА [26].

Следует отметить, что чувствительность определения АЦЦП2 при раннем РА

(<2 лет) несколько ниже, чем при РА [146,253]. В целом, для диагностики раннего РА ПЦПР данного теста составляет 78-97%, а ПЦОР – 66-81% [8,151].

В клинической лабораторной практике также применяются тест-

системы для ИФА, использующие антиген третьего поколения – АЦЦП3 и

его модификацию АЦЦП3.1, позволяющую определять одновременно антитела IgА и IgG изотипов, однако они не превосходят по своему диагностическому значению АЦЦП2 [3,31,34,56,92,119,142,147,201,207].

Кроме этого, G. Lakos и соавт. [118], сравнив ДЧ и ДС АЦЦП IgA, IgG и IgM

изотипов при РА, продемонстрировали преимущество определения именно

IgG АЦЦП2. Обобщенный анализ результатов выявления АЦЦП при различных РЗ показал более высокую ДС данного маркера при диагностике РА по сравнению с IgМ РФ [26,235]. АЦЦП выявлялись при системной склеродермии не более чем у 3% больных, при васкулитах, реактивном артрите и синдроме Шёгрена процент обнаружения колебался от 1% до 8% [26]. Отрицательные результаты определения АЦЦП могут играть существенную роль в дифференциальной диагностике РА с системной красной волчанкой (при наличии эрозивного полиартрита и серопозитивности по IgМ РФ), а также с ревматической полимиалгией

(табл.5) [135,178].

При инфекционных заболеваниях (туберкулез, вирусный гепатит,

иерсиниоз, инфекционный эндокардит) позитивными по АЦЦП являются не

26

более 2% пациентов. Показано, что АЦЦП можно использовать для дифференциальной диагностики РА и полиартропатии, связанной с гепатитом С [44].

Во многих исследованиях отмечено выявление АЦЦП задолго до появления первых симптомов РА. Так при исследовании сывороток здоровых Таблица 5.

Встречаемость АЦЦП при различных ревматических заболеваниях

лиц, у которых впоследствии развился РА, чувствительность АЦЦП2 за 9 лет до появления первых клинических признаков заболевания составляла 4%, а

за 1,5 года - уже 25% при неизменно высокой специфичности (98%) [167].

Кроме этого через год наблюдения за пациентами с недифференцированным артритом (НА) РА развился у 75% положительных по АЦЦП больных, а еще через 3 года у 93% [225]. При НА, длительностью < 9,5 месяцев как АЦЦП1

так и АЦЦП2 позитивными уже в начале наблюдения были 23% больных. На момент постановки диагноза РА эти антитела были обнаружены уже у 51% (АЦЦП2) и 46% (АЦЦП1) обследованных [26]. Отношение риска (ОР)

развития РА составляет 15,9 у здоровых лиц и 37,8 у больных с НА

[144,170].

АЦЦП могут являться прогностическим маркером тяжести течения РА.

ПЦПР и ПЦОР данных антител при прогнозировании тяжелого эрозивного поражения суставов, составляют 63-88% и 58-90% соответственно, что превышает таковые для РФ, СОЭ и СРБ [8,80,109]. Активно обсуждается

27

роль АЦЦП как предиктора развития более выраженной степени суставной деструкции и гораздо более тяжелой клинической картины заболевания, при этом доказано, что его прогностическая ценность в отношении развития тяжелого эрозивного процесса значительно возрастает при совместном определении c SE HLA DRB1*0101, 0104, 0404 [66,252]. Комбинированное определение АЦЦП2 и РФ является оптимальным для прогнозирования характера течения РА в группе пациентов с ранним синовитом [252].

В настоящее время IgM РФ и АЦЦП рассматривают как две различные системы аутоантител, что позволяет выделить два клинико-лабораторных субтипа РА (АЦЦП+ - позитивный и АЦЦП- - негативный), отличающихся по молекулярным механизмам патогенеза, тяжести течения и подходам к проводимой терапии [16,59,114,195,215,218]. АЦЦП – более стабильный серологический маркер РА по сравнению с IgM РФ, реже подвергается сероконверсии в течение заболевания и не зависит от возраста, тогда как частота определения IgM РФ у здоровых лиц увеличивается с возрастом,

достигая 10-30% [16,215]. Повышение концентрации IgM РФ достоверно коррелирует с острофазовыми показателями (СОЭ, СРБ) и в большей степени отражает активность воспаления, чем АЦЦП [215]. На доклинической стадии РА АЦЦП можно обнаружить в сыворотках пациентов за 14 лет до первых симптомов РА, что на 4-5 лет предшествует появлению РФ [144].

Серопозитивность по АЦЦП является важным предиктором развития РА у больных ранним недифференцированным артритом в течение 1-3 лет от начала заболевания (ОР: 19,8-37,8) [26,221]; сопровождается ускоренной рентгенологической прогрессией деструктивного поражения суставов [221] и

тяжелым течением РА с повышением общей летальности и более частым развитием коморбидных состояний, в частности, кардиоваскулярных осложнений [114]. В биоптатах синовиальной ткани у АЦЦП+ больных РА отмечено образование значительного количества воспалительных инфильтратов, очагов лимфонеогенеза и зародышевых центров [221]. Cинтез АЦЦП ассоциируется с определенными генетическими маркерами (HLA-

28

DRВ1, PTPN 22, PAD14, TRAF1-C5, STAT4, OLIG3-AIP3) и факторами внешней среды (курение и др.) [114,221]. Имеются данные, что АЦЦП+

больные РА характеризуются более эффективным ответом на лечение моноклональными антителами к мембранному CD20 антигену В-клеток

(ритуксимаб) и метотрексатом, в то время как АЦЦП- больные лучше отвечают на применение ингибиторов фактора некроза опухоли α (ФНО-α) [84,221].

Таким образом, определение АЦЦП может быть очень полезно для диагностики раннего РА, диагностики серонегативного РА,

дифференциальной диагностики РА с другими ревматическими заболеваниями и прогнозирования тяжелого эрозивного поражения суставов.

Совместное определение АЦЦП и РФ и позволяет осуществлять диагностику РА на ранних стадиях, что важно для своевременного назначения более агрессивной базисной противоревматической терапии.

При диагностике РА АМЦВ проявляют достаточно высокие параметры клинической информативности (ДЧ: 69,5-82%; ДС: 91-97%; ППК: ≈0,8) [13,28,65,217]. При раннем РА АМЦВ проявляют меньшую ДС (67%), чем при развернутом, демонстрируя сходную ДЧ (71%) [13,125,211,224]. В ряде исследований отмечена взаимосвязь содержания АМЦВ с СОЭ и количеством припухших суставов [108,131,243]. Различные авторы приводят противоречивые данные о взаимосвязи уровня АМЦВ с активностью заболевания. Bang и соавт. на небольшой выборке пациентов обнаружили корреляционную зависимость между концентрацией АМЦВ и DAS28 (r=0,404), в то время как Ursum и соавт. не обнаружили подобной взаимосвязи [27,45,167,170,173,217,225,226]. Zimmermann и соавт.

описывают ассоциацию уровня АМЦВ и активности заболевания только у пациентов с DAS28>5 [256]. Кроме этого показано, что АМЦВ/АЦВ могут являться лучшим, чем АЦЦП, предиктором развития тяжелой суставной деструкции [43,131,172]. Отмечено, что одновременный учет результатов

29

тестирования АМЦВ, АЦЦП и IgМ РФ сопровождается увеличением ДЧ до

78% - 100% [13,28,65,217].

При диагностике РА АКА демонстрируют высокую ДС (95-97%) при посредственной ДЧ (36-59%) [103,250]. Во всех исследованиях отмечается связь между позитивностью по АКА тяжестью заболевания и выраженностью суставной деструкции [83,154]. Позитивность по АКА не ассоцируется с наличием HLA-DR4, что характеризует его как потенциально независимый диагностический и прогностический маркер РА [165]. Кроме этого, определение АКА может являться полезным серологическим тестом для дифференциальной диагностики РА с полиартропатией, связанной с гепатитом С [127].

Таким образом, характерной особенностью РА как системного аутоиммунного заболевания является гиперпродукция широкого спектра органонеспецифических антител, среди которых наиболее важное клиническое значение имеют РФ и АЦБ. Положительные результаты тестирования этих аутоантител в сыворотке крови входят в число диагностических критериев РА, применяются для оценки течения и прогноза заболевания, служат предикторами развития РА на ранней (доклинической)

стадии патологического процесса. По данным литературы, АЦБ (АЦЦП и АМЦВ) обладают большей специфичностью для диагностики РА, чем IgM

РФ. В настоящее время IgM РФ и АЦБ рассматривают как различные системы аутоантител, что позволяет выделить два клинико-лабораторных субтипа РА (АЦБ-позитивный и АЦБ-негативный), отличающихся по молекулярным механизмам патогенеза, тяжести течения и подходам к проводимой терапии. АЦБ-позитивный РА ассоциируется с определенными генетическими маркерами и внешними факторами (курение, инфекция и др.),

характеризуется ускоренной рентгенологической прогрессией деструктивного поражения суставов, тяжелым течением болезни с повышением общей летальности и более частым развитием коморбидных состояний. В настоящее время для определения АЦБ используются

30

различные методы иммунного анализа (ИФА, ЭХЛ, НРИФ, ИХА), однако результаты изучения их клинической информативности достаточно противоречивы, что связано с недостаточной стандартизацией и различиями в методических аспектах тестирования данных аутоантител.