диссертации / 122

11

проанализированы их результаты, которые были обобщены, обсуждены и сопоставлены с литературными данными.

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 28 печатных работ: 18

статей, в том числе 4 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МО РФ для публикаций основных результатов диссертационных исследований, и 11 тезисов в материалах российских и международных научных конференций, съездов и конгрессов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения диссертации доложены на Национальных днях лабораторной медицины России (Москва, 2010 - 2013), Межрегиональном форуме «Клиническая иммунология и аллергология – междисциплинарные проблемы» (Казань, 2012), Всероссийской научной конференции молодых ученых - медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века»

(Москва, 2012), I Евразийском конгрессе ревматологов (Алматы, 2012), VI

Съезде ревматологов России (Москва, 2013).

Первичная экспертиза диссертации проведена на межлабораторной конференции ФГБНУ НИИР им.В. А.Насоновой 19 июня 2014 года.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением клинической характеристики пациентов, используемых методов исследования,

собственных результатов, их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 15 отечественных и 242

12

зарубежных источника. Диссертация иллюстрирована 43 таблицами и 16

рисунками.

Работа выполнена на базе ФГБНУ НИИР им. В.А. Насоновой –

(директор – академик РАН, профессор Е. Л. Насонов).

13

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Аутоантитела при ревматоидном артрите

РА – аутоиммунное ревматическое заболевание (РЗ) неизвестной этиологии, характеризующееся хроническим эрозивным артритом

(синовитом) и системным воспалительным поражением внутренних органов

[10,54,79,89,96,192].

Патогенез РА связан с генетически детерминированной и индуцированной факторами внешней среды персистирующей активацией приобретенного и врожденного иммунного ответа против различных патогенов, что приводит к нарушению иммунологической толерантности в отношении собственных антигенов [10,61,78,134]. Ключевую роль в развитии синовиального воспаления и костной деструкции при РА играют активированные CD4+ Т-хелперные (Th) клетки, вызывающие активацию В-

лимфоцитов и макрофагов, а также усиление продукции цитокинов

[53,61,79]. Потеря В-клеточной толерантности при РА способствует выживанию аутореактивных клонов В-клеток и их дифференцировке в аутореактивные плазматические клетки, синтезирующие широкий спектр аутоантител [2,179].

Молекулярная природа аутоантигена, специфичного только для РА,

остается неизвестной. В сыворотке крови и синовиальной жидкости больных РА выявляют аутоантитела к иммуновоспалительным факторам,

цитруллинированным белкам (ЦБ), белкам синовиальной оболочки и хрящевой ткани, белкам теплового шока, убиквитированным внутриклеточным, ядерным и другим антигенам (табл.1) [20,38,42,54,59,62,206,228,234]. Основными серологическими маркерами РА являются IgM РФ и АЦЦП. Положительные результаты их определения входят в классификационные критерии РА и могут использоваться при оценке прогноза заболевания [18,22,148,161,195,208,231]. Клинико-

патогенетическое значение других аутоантител, ассоциированных с РА, мало

14

изучено и их определение не получило широкого распространения в рутинной лабораторной диагностике.

Таблица 1.

Аутоантигены, выявляемые при РА

15

1.2. Ревматоидный фактор

РФ, открытый E. Waaler в 1940 г., представляет собой аутоантитела

IgM, IgA и IgG классов, реагирующие с Fc-фрагментом IgG. В клинической практике наибольшее значение имеет IgM РФ, являющийся серологическим критерием диагностики РА [18,22,242]. Стандартные техники определения

IgM РФ включают реакцию агглютинации сенсибилизированных IgG частиц латекса (латекс-тест) или эритроцитов барана (реакция Ваалер-Розе),

иммунонефелометрический метод (ИНМ) и ИФА. Рекомендуются количественные методы измерения IgM РФ в международных единицах

(МЕ/мл) в сыворотке крови (иммунонефелометрия, ИФА). Положительные результаты определения IgM РФ полуколичественными методами (латекс-

агглютинация), даже в высоких титрах, должны рассматриваться как низко положительные [18]. При использовании общепринятого значения ВГН (1520 МЕ/мл) ДЧ IgM РФ составляет 50-90%, ДС: 80-93%, ОППР: 4,86, ОПОР: 0,38 [14,16,92,119,142,143,148,181,190,201,203,208]. IgM РФ – чувствительный, но недостаточно специфичный маркер для диагностики РА,

так как обнаруживается в сыворотках при других РЗ, хронических инфекциях, злокачественных новообразованиях и в пожилом возрасте (табл. 2).

Таблица 2. Частота обнаружения IgM РФ при различных заболеваниях человека

16

Примечание: *имеются данные об отсутствии увеличения концентрации РФ и частоты его обнаружения с возрастом.

IgM РФ в высокой концентрации является полезным маркером для прогнозирования быстропрогрессирующего деструктивного поражения суставов и системных проявлений при РА [14,16,148,195,200,203,208]. При интерпретации результатов определения IgM РФ необходимо учитывать

17

существование серонегативных по РФ вариантов заболевания.

Серонегативный РА чаще встречается у женщин и больных с дебютом заболевания в пожилом возрасте, чем у мужчин и лиц с началом заболевания в среднем возрасте [8].

IgA РФ часто обнаруживается при РА с полиартикулярным вариантом начала заболевания и внесуставными (системными) проявлениями, при IgA-

нефропатии, синдроме Шегрена, пурпуре Шенлейна-Геноха и инфекционном эндокардите. Обнаружение IgA PФ может обладать определенной прогностической ценностью в отношении развития тяжелой деструкции суставов[105,233]. IgG РФ обнаруживается при различных заболеваниях человека и в настоящее время его клиническое значение до конца не ясно [1].

1.3. Антитела к цитруллинированным белкам

1.3.1.Общая характеристика антител к цитруллинированным белкам

АЦБ – гетерогенная группа аутоантител, распознающих эпитопы белков и синтетических пептидов, содержащих аминокислоту цитруллин

[180]. В настоящее время в сыворотках больных РА идентифицировано более

100 разновидностей АЦБ, включая антиперинуклеарный фактор (АПФ),

антикератиновые антитела (АКА), антифилаггриновые антитела, антитела к цитруллинированному фибриногену, АЦЦП, АМЦВ, антитела к цитруллинированной α-энолазе, цитруллинированным гистонам (HCP1 и HCP2), вирусным цитруллинированным пептидам (EBNA1, EBNA2), [48,50,51,70,87,95,112,128,136,143,145,152,159,181,183,191,237,250] (табл. 1).

ЦБ образуются в результате посттрансляционной модификации остатков аргинина под действием фермента пептидиларгининдеиминазы (ПАД) в

присутствии ионов Ca2+ [182] (рис.1).

18

Рисунок 1. Цитруллинирование белков Цитруллинирование структурных белков является физиологическим

процессом, сопровождающим дифференцировку и апоптоз различных клеток организма [47,63,168,241]. Согласно гипотезе W.J. van Venrooij, при РА факторы внешней среды (инфекции, курение, стресс) служат триггерными механизмами, запускающими массивную инфильтрацию синовиальной ткани воспалительными клетками [231,244]. Развитие синовита характеризуется усилением апоптоза иммуновоспалительных клеток, замедлением клиренса апоптотических клеток и активацией ПАД. Это приводит к цитруллинированию внутриклеточных белков, вторичной гибели клеток и высвобождению из клеток большого количества ЦБ и ПАД с последующим цитруллинированием внеклеточных белков. В синовиальной ткани больных РА ЦБ представлены виментином, α-энолазой, α- и β- цепями фибрина

[126,130,136,238]. Методом иммуногистохимического окрашивания показано накопление ЦБ в синовиальной ткани и при других воспалительных поражениях суставов, однако, в отличие от РА, оно не сопровождается продукцией АЦБ [126]. Полагают, что образование АЦБ при РА тесно связано с развитием патологического иммунного ответа на ЦБ

[67,73,101,145,180,181,237,240,250]. Цитруллинирование белков синовиальной оболочки вызывает их модификацию в виде обнаружения

«скрытых» или формирования новых эпитопов. У больных РА, являющихся носителями аллелей HLA-DR4 (HLA-DRB1*0401 и HLA-DRB1*0404),

цитруллинированные пептидные антигены, связанные на поверхности антиген-презентирующих клеток в виде высокоаффинного комплекса с общей аминокислотной последовательностью в третьей гипервариабельной области HLA-DRβ1, получившей название «shared epitope-SE», распознаются

19

Т-клеточным рецептором (TCR) и вызывают активацию аутореактивных

CD4+ Т- клеток, что индуцирует синтез активированными В-клетками АЦБ

[146]. Эти аутоантитела обладают способностью (прямо или через образование иммунных комплексов) активировать систему комплемента и воспалительные клетки, экспрессирующие Fcγ – рецептор, стимулируя синтез провоспалительных цитокинов, которые, в свою очередь,

рекрутируют новые иммунновоспалительные клетки в синовиальную ткань,

поддерживая цикл хронического воспаления и деструкции тканей сустава

(рис.2) [231].

Рисунок 2. Схема участия АЦБ в патогенезе РА.

В то же время, при наличии у больных «протективной» аллели DRB1*0402

антиген-презентирующие клетки не способны связывать ЦБ. Полученные результаты подтверждают, что иммунный ответ на ЦБ у больных РА может

определяться носительством тех или иных молекул HLA [101].

У пациентов с РА в синовиальной жидкости концентрация АЦЦП почти в полтора раза выше по сравнению с таковой в сыворотке крови, что указывает на локальное продуцирование этих антител клетками синовиальной оболочки [41]. Для определения этих антител в качестве

20

(АЦЦП2,) и третьего поколений (АЦЦП3,

аминокислотная последовательность не опубликована) [181,202].

Виментин присутствует в мезенхимальных клетках, макрофагах, в

синовии и фибробласт-подобных синовиоцитах (рис.3) [100,128,153,239, 248].

Рисунок 3. Структурная модель виментина.

Примечание: N - неспиральный головной домен; С - неспиральный хвостовой домен; 1А, 1В,2А, 2В1 и 2В2 - спиральные сегменты, L12, L2 - неспиральные участки-линкеры; ( )*- число аминокислот.

Это белок молекулярной массой 55 кДа, входящий в состав тканей мезодермального происхождения [23]. Виментиновые филаменты участвуют в регуляции механических взаимодействий между хондроцитами и хрящевым матриксом [71]. Одним из ферментов, регулирующих полимеризацию виментиновых филаментов, является ПАД [23,104,107].

Результатом цитруллинирования виментина является трансформация его тонких внутриклеточных филаментов в аморфные скопления по периферии ядра [23,104]. Vossenaar и соавт. предполагают, что виментин также способен цитруллинироваться в процесе апоптоза макрофагов в очаге ревматоидного воспаления [239]. Также, крайне интересными представляются данные о способности антител к цитруллинированному виментину (АЦВ) не только непосредственно связываться с остеокластами, но и стимулировать их формирование, тем самым усиливая процессы костной резорбции при РА

[214]. В экспериментах по перекрестной реактивности показано, что с ЦЦП связывается лишь ничтожно малое количество АМЦВ, подтверждая наличие у этих антител различных антигенных детерминант [74]. Кроме этого,

гиперпродукция АМЦВ в отличие от таковой у АЦЦП, в большей степени