диссертации / 116

Глава 1. Обзор литературы

1.1.Современные представления о сывороточных маркерах

остеодеструктивных поражений

Активность гуморального иммунитета, участвующего в формировании неспецифической реактивности, зависит от качественного и количественного состояния различных белковых систем крови. Изменение концентрации белков в сыворотке крови во время острой фазы воспалительных и деструктивных процессов определяет защитную реакцию организма (Архипенкова А.А. с соавт., 2003). Этот феномен наряду с адаптационным синдромом и иммунитетом занимает существенное место в общей реактивности организма (Серов В.В.,

Пауков В.С., 1995; Пащенков М.В., Пинегин Б.В., 2001).

Особый интерес среди белков, характеризующих острую фазу воспаления и метаболизм остеобластов, представляет лактоферрин (ЛФ), альфа-2-

макроглобулина (α-2-МГ), щелочная фосфатаза (ЩФ) и ее изомер остаза (ОС), а

также остеокальцин (ОК), характеристики которых могут служить наиболее информативными тестами при патологии опорно-двигательного аппарата.

Лактоферрин является представителем семейства трансферринов,

экспрессируемых эпителиальными клетками внутренних желез млекопитающих.

Его средняя концентрация в сыворотке крови здоровых людей составляет 120 - 300

нг/мл. Данный гликопротеид синтезируется в нейтрофилах с последующим накоплением во вторичных гранулах (Welsh K. J. et al., 2011).

В настоящее время, на мембранах моноцитов, лимфоцитов, нейтрофилов,

эндотелия кишечника, мегакариоцитах и некоторых бактерий обнаружены рецепторы, чувствительные к лактоферрину (Лактионов П.П. с соавт., 1999; Roseanu A. et al., 2000; Puddu P. et al., 2007; Suzuki YA. et al., 2005; MinchevaNilsson L. Et al.,1997; Hammarstrom M. L. et al., 1995; Iyer S. Lonnerdal B., 1993; Haversen L. et al., 2002; Wakabayashi H. et al., 2006; Hwang S.A., 2007; Wilk K.M. et al., 2007). Кроме того, установлено, что он связывается с рецептороподобным липопротеином 1, расположенным на остеобластах, активизируя протеинкиназный сигнальный путь р 42/р 44, что позволяет рассматривать его как терапевтический агент при лечении остеопороза (Grey A. et al., 2004).

10

Известно, что лактоферрин, выступая как хеллатор металла, связывая ионы железа в среде размножающихся бактерий, вирусов, грибов, оказывает прямое антибактериальное, антивирусное и противогрибковое воздействие (Kruzel M.L. et al., 2002; Florisa R. et al., 2003; Clare D.A. et al., 2006; Gifford J.L. et al., 2005; Dzitko

K. еt al., 2007; Okamoto T. еt al., 2004). Помимо этого, за счет конкурентного блокирования рецепторов, которые контролируют вход в клетку хозяина возбудителей ряда инфекций, он предотвращает их вторжение (Drobni P et al., 2004;

Ochoa T.J., 2004; Kawasaki Y. et al.,2000).

В настоящее время ряд исследователей рассматривают лактоферрин как эндогенный фактор защиты, т.к. участвуя в активизации макрофагов, он интенсифицирует процесс фагоцитоза в организме (Трунов А.Н., Кудрявцева И.В.,

2000; Actor J.K. et al., 2004-2009; Hwang SA., et al., 2005-2009). Известно также, что он опосредует реакции между поверхностным натяжением мембран клеток и силой их отталкивания между собой. В результате этого происходит удерживание нейтрофилов в очаге воспаления с увеличением их продолжительности жизни и усилением их бактерицидного действия за счѐт катализизации выделения гидроксирадикалов (Oseas R. et al., 1981; Kawai K. et al., 2007; Ward P.P. et al.,

2008). Под влиянием бактериальных эндотоксинов и липополисахаридов происходит интенсивная дегрануляция нейтрофилов с выбросом лактоферрина в плазму, что сопровождается повышением его концентрации, что в свою очередь приводит к агрегации нейтрофилов между собой и адгезии их к эндотелию сосудов в очаге воспаления (Britigan B.E. et al., 1991; Guillen C. et al., 2000).

Помимо этого, лактоферрин защищает нейтрофилы от окислительного повреждения, ингибируя перекисное окисление липидов, выполняя важную роль в регуляции апоптоза нейтрофилов в нормальных физиологических условиях

(Kruzel M.L. et al., 2006).

Первоначально лактоферрин рассматривали как железосвязывающий белок молока, обладающий бактериостатическими свойствами (Farnaud S., Evans R.W., 2003; Amati L. et al., 2003; Weinberg E.D., 2007). Однако результаты экспериментальных и клинических исследований последних лет определили его значимость во многих физиологических и биологических процессах организма,

связанных со способностью регулировать гомеостаз ионов железа за счет доставки

11

к клеткам ретикулоэндотелиальной системы для коммуляции в виде ферритина.

Поэтому значительное повышение концентрации ЛФ на фоне гипоферримии расценивается как неблагоприятный прогностический признак,

свидетельствующий об обширности повреждения при неполноценной реакции нейтрофилов. Этот феномен послужил основой для определения лактоферрина в группу белков острой фазы воспаления (Лактионов П.П. с соавт., 1999; Miyauchi H.

еt al., 1998; Kawai K. et al., 2007; Ward P.P. еt al., 2008).

Как известно, нарушения в системе гемостаза по пути тромбообразования сопровождаются процессами воспаления сосудистой стенки и патологией нейтрофилов, которые в свою очередь способствуют усилению воспалительной реакции (Трунов А.Н., Кудрявцева И.В., 2000; Guillen C. et al., 2000).

По мнению ряда исследователей, соотношение между функциональной активностью нейтрофилов и концентрацией лактоферрина в плазме крови является показателем деструктивных процессов при артритах различной природы

(Пащенков М.В., Пинегин Б.В., 2001; Степанец О.В. с соавт., 2003). Так, у больных ревматоидным артритом (РА) в период обострения наблюдали повышение уровня лактоферрина в 2-2,5 раза, при этом его концентрация коррелировала со степенью активности воспалительного процесса и функциональной активностью нейтрофилов, что свидетельствует об активности неспецифических эффекторных механизмов (Степанец О.В. с соавт., 2003, М.В. Пащенков и Б.В. Пинегин 2001),

повышение уровня лактоферрина при данной патологии объясняют дегрануляцией нейтрофилов с последующей деградацией и выбросом этого белка в плазму.

Однако у больных с ревматоидным артритом, псориатическим артритом (ПА) и

анкилизирующим спондилоартритом Т.Г. Данилова (2004) наблюдала уменьшение его уровня в крови, а при деформирующем остеоартрозе концентрация ЛФ приближалась к значениям нормы.

D. Muruganand с соавт. (2004) с помощью конкурентного иммуноферментного анализа (ELISA) провели исследования содержания уровня лактоферрина в сыворотке крови больных лепрой, где он был вдвое выше среднего уровня показателей здоровых лиц. Кроме того, было показано, что содержание ЛФ достоверно связано с возрастом и наличием деформаций верхних и нижних конечностей (Muruganand D., Ebenezer D., 2004).

12

Исследования новозеландских ученых позволили установить новую

функцию данного белка, которая позволяет рассматривать его в качестве

регулятора морфогенеза костной ткани. При исследовании смешанной культуры костных клеток было показано, что ЛФ защищает кость от резорбции (Lorget F. et al., 2002), способствуя росту и развитию остеобластов, одновременно ингибируя процессы апоптоза этих клеток (Cornish J. et al., 2004).

Как известно, остеоартрозы (ОА) являются дегенеративными заболеваниями опорно-двигательного аппарата и характеризуются разрушением внеклеточного матрикса с последующей потерей суставного хряща в результате чрезмерной протеолитической активности сериновых протеаз ( Salzet M., 2002; Luan Y. et al.,

2008). При этом процессы воспаления могут прогрессировать при клинико-

рентгенологическом благополучии (Benito M.J. et al., 2004; Felson D.T., 2006). Была установлена зависимость между наличием синовита и развитием в будущем

прогрессирование остеоартрозов с развитием синовита (Krasnokutsky S. et al., 2011;

Felson et al., 2003; Roemer F. et al. 2011).

Известно, что белки семейства пептидазных белков A Disintegriu and

Metalloproteinase proteini (ADAMTS) контролируют многие физиологические и патологические процессы в организме. Среди них ADAMTS-4, ADAMTS -5, ADAMTS- 7 и ADAMTS -12 регулируют метаболизм костной ткани. ADAMTS-5

является ответственным за деградацию агрекана в естественных условиях, а

ADAMTS-4 расщепляет олигомерный матриксный белок хряща (COMP),

фибромодулин и декорин (Vankemmelbeke M.N. et al., 2001; Bayliss M.T. et al., 2001; Rosenberg G.A., 2002; Dickinson S.C. et al., 2003; Kashiwagi M. et al., 2004; Collins-Racie L.A. et al., 2004; Glasson S.S. et al., 2005; Demircan K. et al., 2005; Glasson S.S. et al., 2005; Stanton H. et al., 2005; Behera A.K. et al., 2006; Melching L.I. et al., 2006). ADAMTS- 7 и ADAMTS -12 участвуют в физиологических процессах воспаления в хрящах (Liu C.J. et al., 2006). В ряде исследований было доказано, что

α-2-МГ контролирует и регулирует деятельность этих белков, препятствуя деструкции хрящей, при этом было отмечено значительное увеличение его концентрации в синовиальной жидкости при артритах (Tortorella M.D. et al., 2004;

13

Tchetverikov I. et al., 2003; Loeuille D. et al., 2005; Stahel P. et al., 2007; Gobezie R. et al., 2007; Kapoor M. et al., 2011; Sohn D.H et al., 2012). В связи с этим в настоящее время уровень этого гликопротеида в плазме рассматривается как один из показателей активности остеодеструктивных процессов и как субстрат для разработки лекарственного препарата при лечении артритов (Luan et al., 2008).

α-2-МГ представляет собой гликопротеин молекулярной массой от 716000 до

725000Д. Он присутствует не только в плазме крови и лимфе, но и в синовиальной,

амниотической, спинномозговой жидкостях. Он также обнаружен в субклеточных

α-2-МГ фракциях мембран и тромбоцитах. α-2- макроглобулин синтезируется многими клетками, но основным местом его продукции считаются гепатоциты.

Уровень его в плазме колеблется от 1,5 до 4,2 г/л. Его концентрация у женщин примерно на 20% выше, чем у мужчин (Зорин Н.А., Зорина В.Н., 2004; Зорин Н.А.

с соавт., 2004). Рецепторы к данному белку обнаружены не только на поверхности практически всех видов клеток, но и на внутренних мембранах клеточных органелл

(Birkenmeier G., 2001). Этот тетрамерный гликопротеин способен связывать ряд протеаз как путем включения их в специфическую пространственно организованную «ловушку», так и модифицируя их субстратную специфичность

(Дубровин С.М. с соавт., 2000).

Высокая конформационная пластичность данного белка, а также наличие дополнительного гидрофобного сайта связывания позволяет α-2-МГ участвовать в разных, зачастую функционально противоположных иммунных реакциях (Зорин Н.А. с соавт., 2004). Он является основным переносчиком ряда белков, ферментов и цитокинов, а его различные конформационные формы способны как стимулировать, так и тормозить процессы апоптоза (Baier A. еt al., 2003). Помимо этого, он способен ингибировать фибринолиз: в комплексе с ним плазмин менее активно расщепляет фибриноген и VIII фактор свертывания (Зорина В.Н с соавт.,

2006; Tchetverikov I. et al., 2003).

α-2-МГ играет значительную роль в метаболизме соединительной ткани, где он контролирует процессы синтеза и расщепления коллагена, эластина,

протеогликанов и структурных гликопротеинов (Дубровин С.М. с соавт., 2000;

Birkenmeier G., 2001; Smiley S. et al., 2001). Проведенное тестирование белков плазмы в синовиальной жидкости у больных с остеоартрозами показало, что

14

уровень α-2-МГ по сравнению с другими глобулинами, альбумином и гаптоглобином в несколько раз превышает нормальные значения (Gobezie R. et al.,

2007). Увеличение МГ, как известно, свидетельствует об активности макрофагов и выбросе TNF, ключевого цитокина воспалительного каскада (Kapoor M. et al.,

2011).

Было доказано, что данный гликопротеин влияет на продукцию В-

лимфоцитов и их функциональную активность посредством активации синтеза и высвобождения различных медиаторов, которые способствуют миграции макрофагов и нейтрофилов к зоне воспаления (Мороз А.М., 2001). При системном воспалении α-2-МГ способен связываться с протеазами мембран лимфоцитов,

сегментно-ядерных нейтрофильных гранулоцитов и макрофагов, образуя комплекс,

который в дальнейшем удаляется из организма, что определяет его защитную функцию как второго звена защиты в воспалительном процессе (Зорин Н.А. с

соавт., 2004). Так же α-2-макроглобуллин влияет на способность макрофагов и нейтрофилов мигрировать в участки воспаления.

В.Н. Зорина, Н.А. Трофименко с соавт. (2006) определили положительную корреляцию концентрации α-2-МГ с различными классами иммуноглобулинов в зависимости от активности процесса при ревматоидном артрите. У больных с первой степенью активности повышались только IgM, со второй – IgG, IL-6 при этом уровень α-2-МГ не изменялся. И только при третьей степени активности при значительном увеличении IgG, IgM, IgA, C3, IL-1B, IL-6, наблюдалось повышение концентрации α-2-МГ. На основании этого было сделано заключение, что альфа-2-

МГ у больных ревматоидным артритом отражает степень активности патологического процесса, указывая на его декомпенсированность (Зорина В.Н. с

соавт., 2006).

В научной литературе встречаются сообщения, что у больных лепрой повышение альфа -2-МГ также свидетельствует о активности заболевания. О.В.

Дегтярев, И.Г. Кобяков с соавт. (2007) наблюдали повышение его уровня в крови у больных лепрой и при туберкулезе в 75-78% случаев, тогда как при саркоидозе только в 48%. Некоторые исследователи отмечают значительное повышение активности этого протеина у больных лепрой, осложненной полиартритом (Atkin S. L. et al., 1987). В связи с выше сказанным, изучение динамики α-2-МГ в

15

зависимости от развития остеодеструктивных процессов при лепре является актуальным и требует детального исследования.

Известно, что образование и резорбция костной ткани – это независимые, но тесно сопряженные процессы, поддерживающие биохимическую устойчивость скелета, обеспечивающую сохранение организации костной структуры, ее развитие и прочность (Kleerekoper M., Avioli L.V., 1993; Canalis E., 1993; Lindsay R. 1992).

Значительную роль в этих процессах играет щелочная фосфатаза, которая способна облегчать минерализацию кости путем удаления таких ингибиторов кристаллизации, как неорганический пирофосфат (Mautalen C.A. et al., 1994). Этот фермент локализуется вблизи мембраны клеток или встроен в нее. При гипофосфатазии выявляются нарушения обмена фосфоэтаноламина и пиридоксаль- 5-фосфата, а также и неорганического пирофосфата. В связи с этим полагают, что основная функция щелочной фосфатазы сводится к облегчению поступления в клетку различных эфиров фосфорной кислоты путем их дефосфорилирования, в

противном случае мембрана является для них непроницаемой (Минченко Б.И., 1999). Содержание щелочной фосфатазы в сыворотке крови относительно других органов и тканей невелико (20-140 МЕ/л), но изменение данного показателя

информативно коррелирует с повреждением костной ткани и печени (табл. 1).

Таблица 1 ‒ Концентрация щелочной фосфатазы в различных органах и

тканях

Концентрация ЩФ зависит от возраста пациента и от баланса метаболических процессов в тканях, поэтому имеется ряд исследовательских работ, выявивших различную динамику активности этого фермента при заболеваниях опорно-двигательного аппарата.

16

Таблица 2 ‒ Уровень активности щелочной фосфатазы и остеокальцина

у здоровых лиц в зависимости от возраста

Известно, что псориатический артрит является деструктивной артропатией с явлениями остеопороза, поддерживаемый воздействием провоспалительных цитокинов, особенно TNFα и IL-1β. При этом происходит увеличение уровня активности щелочной фосфатазы в сыворотке, свидетельствующее о направленности изменений костного ремоделирования (Лукина Г.В., с соавт., 2001;

Чернышов П.В.с соавт., 2002; Ritchlin C. еt al., 1998). Однако в группе больных с псориатической артропатией и ревматоидным артритом Ю.В. Семиряд и В.Г.

Родионов (2005) наблюдали значительное увеличение лактоферрина при активности щелочной фосфатазы в пределах контрольных значений, что было расценено как преобладание катаболических процессов и в результате потери костной тканью кальция и фосфора. В группе пациентов с хронической медленно прогрессирующей деформирующей остеоартропатией отмечали высокий уровень ЩФ при снижении сывороточной концентрации кальция и фосфора,

указывающий на активизацию остеобластов по мере стихания воспалительного процесса.

Вопросы метаболизма костной ткани тесно связаны с изучением патогенетических аспектов лепрозного процесса. Данные научной литературы по этому вопросу неоднозначны и зависят от типа лепры и состояния гомеостаза конкретного больного. Так, например, C.A. Mautalen с соавт. (1994) при лепроматозной типе лепры выявили повышение активности щелочной фосфатазы на фоне низкой концентрации общего кальция. M.C. Vidal с соавт. (1993),

17

напротив, не нашли изменения в концентрации ЩФ и остазы у больных

лепроматозным типом лепры. Они выявили циркуляцию ионизированного

кальция в пределах контрольных значений в условиях нормальной рН среды и не измененное количество белков крови.

В ряде научных работ по изучению ферментативной активности циркулирующих лейкоцитов с помощью гистохимического метода в мазках крови было выявлено достоверное снижение активности ЩФ лейкоцитов у больных лепроматозным и туберкулоидным типом лепры относительно здоровых лиц, при этом у лиц с лепрамотозным типом эта тенденция была более ярко выраженной,

чем у пациентов с туберкулоидным типом (Guillet G. et al.,1990). L. Mehta с соавт. (1987) также регистрировали низкий уровень ЩФ эндотелия периферических

нервов. Следует отметить, что у больных с туберкулоидным типом лепры данный

показатель был выше, чем при лепроматозном типе (Mautalen C.A. с соавт. 1994)

отмечают увеличение активности ЩФ на фоне снижения концентрации общего кальция в сыворотке крови больных лепроматозным типом.

Накопленный опыт в изучении динамики ЩФ при многих патологических состояниях и особенно в диагностике метастазов костей у онкологических больных свидетельствует в пользу низкой специфичности и чувствительности данного

маркера (Chambers A. F. at al., 2002; Насонов Е. Л. с соавт., 1997). Ввиду этого

перспективным является изучение костной фракции щелочной фосфатазы – остазы.

Костная фракция щелочной фосфатазы – остаза (ОС) – синтезируется активно делящимися остеобластами. Доказана корреляция между уровнем концентрации остазы и скоростью формирования кости в зависимости от возраста

(таблица 2) (Epstein S., 1998). Остаза представляет собой тетрамерный

гликопротеин, локализующийся на клеточной поверхности остеобластов.

Специфичность фермента, а также такие характеристики его метаболизма, как вpемя полужизни в кpови (составляющее 1-2 дня), отсутствие метаболизма в печени, выведение почками, приближают остазу к идеальным маркерам активности остеобластов. Значительное увеличение активности остазы в сыворотке крови наблюдается при повышенной деятельности остеобластов: при росте костей у детей, последнем триместре беременности, возобновлении движений после длительного постельного режима, при переломах, деформирующем остите, болезни

18

Педжета, рахите, гиперпаратиреозе. Повышение активности ОС при рахите отмечается чаще, чем увеличение содержания неорганического фосфора; при выздоровлении активность ОС нормализуется позднее, чем уровень Са и Р, и

примерно в те же сроки, что и рентгенологические показатели.

Повышение активности остазы характерно и для процессов остеомаляции злокачественных опухолей костей, миеломе, а также для костного туберкулеза и лейкозов. Доказана корреляция между уровнем концентрации остазы и скоростью формирования кости. Эти данные подтверждаются инвазивными методами обследования – гистоморфометрией и кинетикой радиоактивного кальция в организме (Bettica P. et al., 1995). Повышение уровня концентрации остазы в сыворотке крови связывают с активностью процессов дифференцировки остеобластов, что имеет место в условиях ускоренного формирования кости, что это было доказано на клинических примерах метастазирования в костную ткань у онкологических больных (Withold W. et al., 1994).

Учитывая, что количественное определение остазы дает полезную информацию о костном ремоделировании у пациентов с различными заболеваниями опорно-двигательного аппарата, исследование динамики этой изоформы щелочной фосфатазы представляется актуальным у больных с инвалидизирующими осложнениями при лепре.

Одним из перспективных и интенсивно изучаемых маркеров образования кости является остеокальцин (ОК). Это витамин К-зависимый неколлагеновый белок костной ткани, который синтезируется зрелыми остеобластами,

одонтобластами и гипертрофированными хондроцитами. Под влиянием фактора некроза опухоли (ФНО), который является мощным индуктором костной резорбции и играет определенную роль в развитии ноцицептивного ответа,

происходит дифференциация остеобластов, представляющая собой многоступенчатый процесс с участием многочисленных генов, щелочной фосфатазы и остеокальцина (Rani S.et al, 2010). Известно, что на активность остеобластов, продуцирующих остеокальцин, оказывает влияние уровень паратиреоидного гормона в крови, ингибируя их деятельность (Garnero P., et al., 1996).

19