66. Проект «Геном человека».

Ответ. К реализации программы «Геном человека» приступили в конце 80-гг. XX ст. Ее инициаторы планировали определить полную последовательность всех 3 млрд. нуклеотидных звеньев генома человека к 2005 г. В США изучением генома занималось два коллектива: сотрудники Национального института исследования генома человека (глава – Френсис Коллинз) и сотрудники частной фирмы Celera Genomics Институт геномных исследований (глава – Крэйг Вентер). Результаты расшифровки и анализа генома человека были независимо опубликованы двумя организациями в феврале 2001 г. с разбежкой в один день. Геном человека был полностью секвенирован в 2003 г. на сегодняшний день секвенировано 90% генома в черновом виде, 30% – в окончательном. В компании Celera Genomics для секвенирования было отобрано по одной биопробе от афроамериканца, китайца, испано-мексиканца и две от европейцев. Этот генетический материал позволил рассчитать консенсусную последовательность генома человека длиной 2,91 млрд. п. н. В процессе секвенирования генома преследовалось три цели. Создание точной генетической карты. Создание физической карты. Секвенирование всего генома человека. Нерасшифрованные участки: саттелитная ДНК теломерных и околоцентромерных районов хромосом; сильно спирализированные области интеркалярного (внутрихромосомного) гетерохроматина, способные ярко окрашиваться красителем Гимза и флуорохромами; небольшие интерстициальные фрагменты гэпы (gaps).

67. Основные принципы и методология генотерапии.

Ответ. В широком смысле слова генная терапия – это лечение, основанное на введении в ткани или в клетки пациента смысловых последовательностей ДНК. Первые представления о практических аспектах и возможностях использования генной терапии были несколько ошибочными. Например, думали, что посредством генотерапии будут исправляться дефекты в генах. В качестве основного объекта для такого лечения рассматривали моногенные наследственные заболевания человека. Не исключали возможность коррекции генного дефекта в соматических и зародышевых клетках. На самом деле оказалось: значительно проще вводить в организм пациента полноценно работающий ген (как правило – это его кДНК); в норме экспрессия дефектного гена происходит именно в соматических тканях. Генная терапия на уровне половых и зародышевых клетках сопряжена с большим риском серьезных последствий для генофонда человечества; генная терапия – это эффективный способ борьбы как с моногенными наследственными заболеваниями, так и с широко распространенными болезнями (злокачественными опухолями, многими вирусными инфекциями, патологиями сердечно-сосудистой системы и другими). В современном понимании генная терапия – это лечение наследственных, онкологических, некоторых инфекционных (вирусных) и других заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов либо придания клеткам новых функций. Первые клинические испытания методов генной терапии: май 1989 г. – маркирование опухоли-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы; сентябрь 1990 г. – в Бетезде (США) 4-летней девочке, страдающей наследственным иммунодефицитом (частота встречаемости – 1:100000), обусловленным мутацией в гене аденозиндезаминазы, пересажены ее собственные лимфоциты, предварительно трансформированные ex vivo геном АDА (ген АDА + ген nео + ретровирусный вектор). В течение трех лет терапии в общей сложности проведено 23 внутривенных трансфузии АDА-трансформированных Т-лимфоцитов без видимых неблагоприятных эффектов. Результат нового подхода к борьбе с этим редким заболеванием – улучшение состояния пациентки, возвращение ее к нормальному образу жизни. Результативное использование генной терапии в медицине во многом стало возможным благодаря успехам молекулярной биологии, инструменты которой позволили: картировать гены, мутации которых приводят к наследственным заболеваниям; выяснять молекулярную природу этих мутаций; секвенировать и клонировать гены; создавать генно-инженерные конструкции с последующей их доставкой в клетку. Следует также отметить, что качественному скачку в области генной терапии поспособствовало доказательство ее безопасности, установленной по результатам первых исследований. В то же время до сих пор недостаточно изучены последствия манипулирования генами или рДНК іn vivо. Введение в организм человека последовательностей ДНК, которые не находятся под контролем свойственных им регуляторных элементов – это вероятная причина непредсказуемых изменений метаболических процессов на фоне функционального дисбаланса. Есть мнение, что современные представления о структуре генома и его взаимодействиях с экзогенными ДНК и вирусными последовательностями (векторами, используемыми в генной инженерии) пока недостаточны для прогнозирования возможных нежелательных или неконтролируемых последствий. Поэтому до использования программ генной терапии следует удостовериться в их безопасности для самого пациента и для популяции в целом. Как минимум ожидаемый лечебный эффект или возможность получения дополнительной полезной информации должны преобладать над потенциальным риском предлагаемой процедуры. Обязательные разделы программ генной терапии для клинических испытаний: определение типа клеток, которые подлежат генетической модификации; обоснование выбора нозологии для проведения курса генной терапии; схема конструирования экзогенной ДНК; обоснование биологической безопасности вводимой генной конструкции, включающее опыты на культурах клеток и на модельных (трансгенных) животных; способ переноса генной конструкции в клетки пациента; методы анализа экспрессии введенных генов; оценка клинического (терапевтического) эффекта; возможные побочные последствия и их профилактика. Особое внимание в программе генной терапии уделяется анализу последствий проводимых процедур. Этот контроль проводится на каждом этапе терапии, причем исследования выполняются на различных уровнях. После переноса гена отыскиваются модифицированные клетки, и изучается их динамика в определенных тканях. С целью облегчения такого поиска в генетические конструкции включаются гены-маркеры. В последнее время последовательности экзогенной ДНК в модифицированных клетках обычно идентифицируются посредством ПЦР. На следующем этапе анализируется экспрессия введенных генов путем идентификации и количественной оценки соответствующего РНК-транскрипта либо белкового продукта гена. При возможности анализируется коррекция первичного биохимического дефекта. Проводится сопоставление полученных данных с результатами комплексного медицинского обследования, исправляется и дополняется схема лечения. Типы генотерапевтических вмешательств. Выбор клеток-мишеней. Клетки, в которые вводятся последовательности ДНК, называются клетками-мишенями. Генная терапия позволяет: корректировать наследственные патологии – последствия генетических дефектов; придавать клеткам новые функции, способствующие исключению патологий. В первом случае в организм вводится нормально работающий гомолог дефектного гена. В основе второго подхода лежит использование генов, обладающих условным цитотоксическим эффектом или способствующих формированию выраженного иммунного ответа (применяют при лечении опухолей или инфекций). Мишенями для таких генов служат пораженные ткани, иммунные клетки, специфическим образом проникающие в эти ткани, либо предварительно трансформированные іn vitro другие клетки. Таким образом, в зависимости от характера заболевания и предполагаемого генотерапевтического подхода объектом генетической трансфекции могут служить самые разные соматические клетки, как несущие дефектный ген, так и нормальные клетки, приобретающие терапевтические свойства после трансфекции. Генная терапия проводится или в культуре клеток (еx vivo), или в организме (іn vivo), что определяется способом введения экзогенных ДНК в геном. В первом случае выделяются и культивируются специфические типы клеток пациента. После в них вводятся чужеродные гены, отбираются трансфецированные клетки, которые вводятся тому же пациенту. Сегодня большинство программ генной терапии основано именно на этом подходе. Факторы, ограничивающие реализацию таких программ: возможны лишь в крупных специализированных центрах, большие материальные затраты и необходимость в высоких биотехнологиях. Во втором случае осуществляется прямое введение клонированных и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в специфические ткани больного. Вводимые ДНК обычно интегрируются с молекулами, обеспечивающими их адресную доставку в клетки-мишени. Этот подход на перспективу найдет широкое применение в массовом лечении распространенных заболеваний. Пока он используется в борьбе с муковисцидозом. Этапы генной терапии. Получение клеток от больного. Использование собственных клеток пациента (аутологичных клеток) исключает вероятность развития иммунного ответа после инфузии или трансплантации. Культивирование клеток в питательной среде. Перенос терапевтическог гена. Отбор и наращивание генетически исправленных клеток. Введение клеток реципиенту. Методы генетической трансфекции в генной терапии. Трансфекция – это искусственное введение в клетки эукариот изолированных молекул ДНК. Условия, обеспечивающие успех генотерапии: эффективная доставка чужеродного гена в клетки-мишени; длительная персистенция гена в клетках-мишенях; экспрессия – полноценная работа введенного гена. При трансфекции используются: чистые («голая» - naked) ДНК, лигированные в плазмиду; комплексированные ДНК – плазмидные ДНК, комплектованные с солями, белками (трансферрином), органическими полимерами (декстраном, полилизином), липосомами или частицами золота; ДНК, входящие в состав вирусных частиц, предварительно лишенные способности к репликации. Чтобы персистенция была длительной, чужеродная ДНК в клетках-реципиентах должна встроиться в геном – в ДНК клетки-хозяина. Экзогенная ДНК элиминируется, если она в ядре находится в свободном состоянии. Экспрессия чужеродной ДНК возможно лишь при наличии соответствующих промоторов. Чужеродные гены доставляются в клетки посредством химических, физических и биологических методов. Эффективность введения чужеродных генов in vitro обеспечивают такие физические способы как электропорация, бомбардировка частицами золота, а также практически все виды биологической доставки. В то же время реальная интеграция в геном клетки-реципиента достигается, если используются ретровирусные или аденоассоциированные вектора, так как они имеют свойства, необходимые для встраивания в эукариотическую ДНК. Лишь вирусные векторы или генетические конструкции с вирусными последовательностями способны к активной трансфекции, а в ряде случаев – и к длительной экспрессии чужеродных генов.