21. Трансформация.

Ответ. Трансформация бактерий – это перенос ДНК, изолированной из одних клеток, в другие. При трансформации ДНК, выделенную из клеток одного штамма, поглощают клетки другого штамма – реципиента. Трансформация возможна у целого ряда бактерий: Diplococcus, Hemophilus, Neisseria, Bacillus, а также у актиномицетов, цианобактерий и других, и она имеет общие закономерности. Лучше всего трансформация изучена у таких бактерий, как D. pneumoniae, В. subtilis, Н. influenzae. Для того чтобы ДНК проникла в бактериальные клетки, они должны находиться в состоянии компетентности. Сначала ДНК связывается с поверхностью компетентных клеток. Обычно трансформирующая ДНК имеет молекулярную массу около 1×10⁷ Д, что составляет около 0,5% бактериальной хромосомы. ДНК, связанная с компетентными клетками, расщепляется специальными нуклеазами до фрагментов с молекулярной массой 4-5×10⁶ Д. После этого фрагменты ДНК проникают в клетку. Некоторые бактерии, в частности пневмококки, могут неспецифически поглощать ДНК из разных источников. В то же время, например, Hemophilus, поглощает только свою, гомологическую ДНК. Фрагменты менее 5-10⁵ Д в клетку не проникают. После попадания в бактерию двуцепочечная ДНК превращается в одноцепочечную: одна нить ДНК деградирует. На заключительной стадии происходит интеграция одноцепочечного трансформирующего фрагмента с ДНК клетки-реципиента. При этом репликация не требуется, и включаемый фрагмент физически объединяется с ДНК реципиента. Весь процесс трансформации завершается в течение 10-30 мин. Частота трансформации разных бактерий составляет около 1%. Для некоторых бактерий показана трансформация в естественных условиях, например, в организме инфицированного животного – для Diplococcus pneumoniae, а также в условиях культуры – для Bacillus sublilis. Это означает, что трансформация – не экзотический прием генетического анализа, а естественный биологический процесс. В то же время в последние годы в связи с развитием генной инженерии широко применяется плазмидная трансформация, которая заключается во введении в клетки бактерий, а также эукариот генов, интегрированных в естественные или искусственные плазмиды.

22. Трансдукция. Использование бактериофагов для картирования хромосомы бактерий.

Ответ. Трансдукцией называют перенос генов из одних бактериальных клеток в другие при помощи бактериофага. Это явление в 1951 г. открыл Н. Зиндер. Перед рассмотрением трансдукции важно изучить взаимоотношения между бактериями и бактериофагами. Бактериофаги, или вирусы бактерий, делят на две категории: вирулентные и умеренные. Вирулентный бактериофаг, проникая в клетку, вызывает литическую реакцию, т.е. размножается и лизирует бактерию. Умеренные бактериофаги могут вызывать как литическую, так и лизогенную реакцию. В последнем случае инфицирующий фаг переходит в состояние профага, который воспроизводится синхронно с хромосомой бактерии. Бактерии, несущие профаг, называют лизогенными. Лизогенные бактерии приобретают иммунитет, т.е. устойчивость к дополнительному заражению тем же бактериофагом, который их лизогенизировал. Лизогенное состояние устойчиво воспроизводится. Профаг при этом теряется с частотой около 1 на 10⁵-10⁶ клеточных делений. В лизогенных культурах может происходить индукция бактериофага, в результате чего наблюдается массовый лизис бактерий. Такое явление происходит спонтанно и стимулируется целым рядом агентов, повреждающих ДНК: ультрафиолетовыми и рентгеновскими лучами, алкилирующими соединениями, органическими перекисями и т.д. Виды трансдукции. Общая трансдукция. Трансдукцию осуществляют умеренные бактериофаги. К их числу относится фаг Р22, при помощи которого Н. Зиндер впервые обнаружил трансдукцию у Salmonella typhimurium. Два штамма этой бактерии, нуждавшиеся в аминокислотах, высевали в смешанной культуре на минимальную среду. В результате появились прототрофные колонии с частотой около 1×10^-4. Как видно, логика эксперимента была та же, что и при поисках конъюгации у Е. coli. Иными оказались результаты выращивания двух названных штаммов S. typhimurium в разных отростках U-образной трубки, разделенных бактериальным фильтром. Рекомбинанты были получены и в этом случае. Следовательно, для их образования не нужен контакт между клетками, как при конъюгации. Перенос генов при общей трансдукции может привести к двум различным состояниям трансдуктантов. В одних случаях привнесенный ген наследуется стабильно, поскольку интегрирует с хромосомой реципиента. Это полная трансдукция. В других случаях при абортивной трансдукции внесенный фагом фрагмент генома не реплицируется и передается по одной линии при размножении трансдуктанта, т.е. из двух клеток – потомков каждого деления – лишь одна получает трансдуцированный ген. Так можно трансдуцировать ген, определяющий наличие жгутика у S. typhimurium. В этом случае во всем клоне – потомстве трансдуктанта – жгутик, а, следовательно, подвижность сохраняет только одна клетка. Абортивная трансдукция происходит чаще, чем полная, иногда в 10 раз. Специфическая трансдукция отличается от неспецифической тем, что бактериофаг может переносить только определенные гены, как это характерно для фага к Е. coli, который может трансдуцировать только гены локуса gal, ответственного за усвоение галактозы, и bio – гены синтеза биотина. Умеренный бактериофаг при лизогенизации Е. coli интегрирует в ее хромосому на участке между локусами gal и bio. Это было показано в конъюгационных скрещиваниях лизогенных Hfr и нелизогенных F--бактерий. Gal+-трансдуктанты возникают обычно с частотой 1×10^-5-10^-6 и, как правило, генетически нестабильны. Они выщепляют клетки Gal-1 частотой около 2×10^-3 на клеточное деление. Это явление объясняется тем, что трансдуктанты Gal+ частично гетерозиготны gal/gal+ т.е. несут дополнительный фрагмент gal+ вместе с участком gal реципиента. Такое состояние называется гетерогенотой. При облучении гетерогенот УФ-лучами удалось получить фаголизаты, способные к трансдукции с очень высокой частотой. Почти половина всех частиц λ могла передавать признак Gal+ при трансдукции. Изучение фагов из таких лизатов, названных HFT, показало, что гены gal переносят так называемые дефектные фаги λ, т.е. такие, которые, лизогенизируя бактерии, сообщают им устойчивость к суперинфекции λ, но в дальнейшем лизогенные бактерии не способны продуцировать инфекционные частицы бактериофага. Дефектные трансдуцирующие частицы λ, обозначаемые к gal, не образуют стерильных пятен на газоне Е. coli. Они не могут самостоятельно размножаться. Для этого им требуется фаг – помощник: нормальный, не способный к трансдукции.