17. Системы рестрикции-модификации (r-m системы), их биологическая роль.

Система рестрикции-модификации — ферментативная система бактерий, разрушающая попавшую в клетку чужеродную ДНК. Основная её функция — защита клетки от чужеродного генетического материала, например, бактериофагов и плазмид. Для компонентов системы характерны два типа активности — метилтрансферазная (метилазная) и эндонуклеазная. За каждую из них могут отвечать как отдельные белки, так и один белок, сочетающий в себе обе функции.

Система рестрикции-модификации (СР-М) специфична по отношению к определённым последовательностям нуклеотидов в ДНК, называемых сайтами рестрикции. Если определённые нуклеотиды в последовательности не метилированы, эндонуклеаза рестрикции вносит в ДНК двуцепочечный разрыв (часто — со смещением на несколько нуклеотидов между цепями), при этом биологическая роль молекулы ДНК нарушается. В случае, когда метилирована только одна из цепей ДНК, расщепления не происходит, вместо этого метилтрансфераза добавляет метильные группы к нуклеотидам второй цепи. Подобная специфичность СР-М позволяет бактериям проводить селективное расщепление чужеродной ДНК, не затрагивая собственную. В норме вся ДНК в бактериальной клетке либо полностью метилирована, либо полностью метилирована только по одной цепи (сразу после репликации). Напротив, чужеродная ДНК не метилирована и подвергается гидролизу.

СРМ первого типа образованы пятью субъединицами, которые функционируют как единое целое. Субъединицы обозначаются аббревиатурой Hsd (host specificity determinant) и буквой, соответствующей функции (M — ДНК-метилтрансфераза, R — эндонуклеаза рестрикции, S — распознавание субстрата). СР-М первого типа представляют собой комплекс двух HsdM, двух HsdR и одной HsdS. HsdR расщепляет фосфодиэфирные связи в ДНК и обладает геликазной активностью. HsdM производит метилирование остатков аденина в составе сайтов рестрикции по шестому атому азота (m6A). HsdS обеспечивает распознавание определённых участков ДНК, определяя специфичность СР-М.

18. Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы): номенклатура, классификация (от размера сайта рестрикции, по механизму действия и молекулярной структуре, а также характеру расщепления нуклеотидной последовательности). Изомеры рестриктаз.

Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы (от лат. restrictio — ограничение) — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот.

В отличие от экзонуклеаз, рестриктазы расщепляют нуклеиновые кислоты не с конца молекулы, а в середине. При этом каждая рестриктаза узнаёт определённый участок ДНК длиной от четырёх пар нуклеотидов и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его.

Защита бактериального генома от собственной рестриктазы осуществляется с помощью метилирования нуклеотидных остатков аденина и цитозина (маскированием).

Номенклатура. Названия рестриктаз складываются из первых букв видовых названий бактерий, в которых они обнаружены, например Eco – E. coli. В том случае, когда различные по специфичности действия рестриктазы присутствуют в клетках разных штаммов одного вида бактерий, в название рестриктазы вводят дополнительную букву, например рестриктазы Hinc и Hind выделены из бактериальных клеток Haemophilus influenzae, штаммы с и d. Цифры, следующие за буквенными обозначениями, отражают последовательность открытия соответствующих рестриктаз в клетках бактерий одного вида, например HaeI, HaeII и HaeIII из H. aegipticus.

Классификация рестриктаз. В классической классификации рестриктазы делятся на 4 типа в зависимости от сайта рестрикции, и требований к кофактору.

К I типу рестриктаз относят сложные, состоящие из нескольких субъединиц, Р-М системы, которые разрезают ДНК на случайном расстоянии от своего сайта рестрикции.

Ферменты II типа разрезают ДНК в пределах или на небольшом удалении от своих сайтов рестрикции. Они создают отдельные рестрикционные фрагменты и различимые на геле паттерны. Это единственный тип ферментов, который используется в лабораторных условиях при изучении ДНК и клонировании генов. Они представляют класс белков, которые нередко играют важную роль во взаимодействии паразит-хозяин.

Ферменты III типа также представляют собой большие белковые комплексы. Они разрезают ДНК вне своих сайтов рестрикции и им необходимы два таких сайта в противоположных направлениях в пределах одной молекулы ДНК, чтобы завершить разрезание.

Ферменты IV типа узнают модифицированную, как правило – метилированную ДНК, и представляют собой McrBC и Mrr системы E.coli.

По механизму действия и молекулярной структуре различают три типа рестриктаз. Ферменты рестрикции типа I представляют собой сложные мультимерные комплексы, построенные из трех субъединиц с молекулярной массой до 300 кДа, которые обладают рестриктазной, ДНК-метилазной и АТРазной активностями. Рестриктазы типа I для проявления своей активности требуют присутствия ATP, S-аденозилметионина и ионов Mg2+, они не распознают специфические последовательности нуклеотидов и в силу этого не находят широкого применения в генной инженерии.

Рестриктазы типа II узнают специфические последовательности нуклеотидов в точке расщепления ДНК или непосредственной близости от нее, требуют для проявления активности наличия в реакционной смеси ATP и ионов Mg2+ и чаще всего используются при молекулярном клонировании.

Ферменты типа III также активны только в присутствии ATP и ионов Mg2+ и не проявляют абсолютной зависимости от S-аденозилметионина.

На основании субъединичной структуры, субстратной специфичности, потребности фермента в кофакторах и характера расщепления ДНК выделяют четыре типа систем рестрикции модификации (I, II, III и IV).

Ферменты I-го типа осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК, а ферменты II-го и III-го типов узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них расстоянии.

Ферменты типов I и III имеют сложную субъединичную структуру и обладают двумя видами активностей - модифицирующей (метилирующей) и АТФ-зависимой эндонуклеазной. Они нуждаются в ионах магния и S-аденозил-L-метионине в качестве кофакторов.

Эндонуклеазы системы типа IV расщепляют только модифицированную ДНК, имеющую в составе метилированные, гидроксиметилированные или гликозил-гидроксиметилированные основания.

Изомеры рестриктаз. Изошизомеры — это пары эндонуклеаз рестрикции, имеющих специфичность к распознаванию одинаковых последовательностей, но иногда отличающихся по наличию метилированных нуклеотидных остатков, и разрезающих эти последовательности в одинаковых местах. Первый выделенный фермент для узнавания и специфического разрезания заданной последовательности, называют прототипом, а все остальные подобные рестриктазы называют изошизомерами.

Фермент, узнающий такую же последовательность, но разрезающий её по-другому, называют гетерошизомером (неошизомером). Изошизомеры, таким образом, являются частным случаем гетерошизомеров.

Рестриктазы, распознающие совершенно разные последовательности, но образующие одинаковые концы, называют изокаудомерами.