4. Полуконсервативный механизм репликации днк. Опыт Мезельсона и Сталя (1958).

Репликация ДНК – это процесс, осуществляемый комплексом ферментов и белков, выполняющих топологическую функцию, суть которого в образовании идентичных копий ДНК для передачи генетической информации в поколениях клеток и организмов.

Синтез каждой дочерней цепи ДНК идет комплементарно и антипараллельно матричной цепи и всегда в направлении 5' 3'.

Доказательство полуконсервативного характера репликации

Для выяснения вопроса о характере расхождения цепей по дочерним молекулам Мэтт Мезельсон и Фрэнк Сталь в 1958г. разработали метод равновесного центрифугирования в градиенте плотности CsCl. Этот метод позволяет разделять молекулы ДНК по их плотности: каждая молекула остановится в том месте градиента, где плотность раствора совпадает с её плавучей плотностью. Авторы применили этот метод для разделения молекул ДНК, содержащих изотопы азота ¹⁴N и ¹⁵N. ¹⁵N не радиоактивен, а лишь тяжелее ¹⁴N. Содержащие тяжелый изотоп молекулы ДНК функциональны и могут удваиваться.

Мезельсон и Сталь показали, что, если вырастить несколько поколений бактерий Escherichia coli в среде, богатой ¹⁵N или ¹⁴N, затем центрифугировать их ДНК в градиенте плотности хлористого цезия, то окажется, что более тяжёлая ¹⁵N-ДНК останавливается ближе ко дну центрифужной пробирки, чем ¹⁴N-ДНК.

Для того чтобы установить механизм репликации, E. coli, которые в течение нескольких поколений росли в ¹⁵N-содержащей среде (а значит, их ДНК содержала только ¹⁵N) были перенесены в ¹⁴N-содержащую среду, где им было позволено поделиться только один раз. Плотность выделенной из этих клеток ДНК оказалась больше плотности ДНК бактерий, выращенных в среде, богатой ¹⁴N, но меньше плотности ДНК бактерий, выращенных в ¹⁵N среде. Это противоречило гипотезе о консервативном характере репликации ДНК, при котором ДНК разделились бы на две фракции с высокой и низкой плотностью, но не с промежуточной. Таким образом, первая гипотеза была отброшена.

Однако полученный результат не исключал дисперсный механизм репликации, при котором участки материнской ДНК чередуются с участками дочерней ДНК. Чтобы выяснить, какой из оставшихся механизмов верен, была проанализирована плотность ДНК второго поколения бактерий. По гипотезе дисперсной репликации плотность ДНК второго поколения бактерий должна быть одинаковой для всех молекул и занимать промежуточное положение между плотностью ДНК клеток первого поколения и плотностью самой лёгкой ДНК. Оказалось, однако, что клетки второго поколения содержали примерно равные количества лёгких и гибридных ДНК. Этот факт позволил исключить гипотезу дисперсного механизма репликации.

Полуконсервативность означает, что каждая дочерняя ДНК состоит из одной матричной цепи и одной вновь синтезированной.

5. Свойство анипаралленльности цепей в молекуле днк. Биологический смысл. Правило Чаргаффа.

Антипараллельность – цепочки ДНК лежат друг к другу противоположными концами.

Мономером ДНК является нуклеотид, центральной частью нуклеотида – дезоксирибоза. У неё 5 атомов углерода. Смотрим: к первому атому углерода присоединяется азотистое основание, к пятому – фосфорная кислота данного нуклеотида, третий атом готов присоединить фосфорную кислоту следующего нуклеотида. Таким образом, у любой цепочки ДНК есть два конца:

5'-конец, на нем располагается фосфорная кислота;

3'-конец, на нем располагается рибоза(конец несет гидроксильную группу (- ОН)).

Правило антипараллельности состоит в том, что на одном конце двойной цепи ДНК одна цепь имеет 5'-конец, а другая 3'-конец. Для процесса репликации важно, что ДНК-полимераза может удлинять только 3'-конец. Цепочка ДНК может расти только своим 3'-концом.

Ферменты, синтезирующие новые нити ДНК и называемые ДНК-полимеразами, могут передвигаться вдоль матричных цепей лишь в одном направлении от 3'-конца к 5'-концу. Поэтому в процессе репликации одновременный синтез новых цепей идет антипараллельно.

Правило Чаргаффа

Чаргаффу удалось разделить нуклеотиды ДНК при помощи бумажной хроматографии и определить точные количественные соотношения нуклеотидов разных типов. Соотношения, выявленные Чаргаффом для аденина (А), тимина (Т), гуанина (Г) и цитозина (Ц), оказались следующими:

Количество аденина равно количеству тимина, а гуанина — цитозину: А=Т, Г=Ц.

Количество пуринов равно количеству пиримидинов: А+Г=Т+Ц.

Количество оснований с аминогруппами в положении 6 равно количеству оснований с кетогруппами в положении 6: А+Ц=Т+Г.

Вместе с тем, соотношение (A+Т):(Г+Ц) может быть различным у ДНК разных видов. У одних преобладают пары АТ, в других — ГЦ.

Правила Чаргаффа, наряду с данными рентгеноструктурного анализа, сыграли решающую роль в расшифровке структуры ДНК Дж. Уотсоном и Френсисом Криком.