19. Клонирование днк in vitro.

Клонирование ДНК – процесс получения большого числа копий фрагмента молекулы ДНК. Клонирование ДНК in vitro – амплификация методом ПЦР. Клонирование ДНК часто применяют для амплификации фрагментов, содержащих гены, а также любые другие последовательности – например, промоторы, не кодирующие последовательности, химически синтезированные олигонуклеотиды и случайные участки ДНК.

Полимеразная цепная реакция – ферментативная реакция, осуществляемая in vitro с помощью термостабильной ДНК-полимеразы на матрице ДНК с использованием олигонуклеотидных ДНК-затравок (праймеров), комплементарных нуклеотидным последовательностям противоположных цепей ДНК на границах амплифицируемого участка. Если кратко, то ПЦР – искусственная амплификация последовательности ДНК путём повторных циклов репликации и разделения нитей.

ПЦР применяют при клонировании генов, генотипировании организмов, диагностике наследственных инфекционных и онко-заболеваний; идентификации личности, установлении родства; в криминалистике, при анализе древних остатков в эволюционной биологии; при детекции ГМО. Этот метод изобрёл Кэри Мюллис в 1983 году.

Что же нужно для ПЦР? Основные компоненты:

ДНК-матрица (анализируемая ДНК).

ДНК-полимераза. Обычно используют термостабильные полимеразы, выделенные из термофильных бактерий и архей: Thermus aquaticus (Taq-полимераза, 40 мин), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза, 120 мин) и Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза, 120 мин). Также используются Vent (400 мин), DeepVent (1300 мин), UITma (50 мин), Tth (20 мин).

Буфер. Раствор, содержащий а) различные ионы для поддержания нужного рН; б) соли магния, необходимые для работы полимеразы; в) неионный детергент Tween-20 в сочетании с BSA (бычьим сывороточным альбумином) для предотвращения налипания компонентов реакции на стенки пробирки.

Праймеры. Один из праймеров обычно соответствует началу амплифицируемого отрезка, другой — его концу, но на противоположной цепи.

Дезоксинуклеотидтрифосфаты (αNTP): дАТФ, дТТФ, дЦТФ и дГТФ.

Дополнительные компоненты:

ДМСО (5%) – улучшает амплификацию GC-богатых матриц и отжиг праймеров.

Формамид (1-5%) – улучшает специфичность реакции.

Глицерин (1-10%), БСА (0,01-0,1%), Triton X-100 (0,05-0,1) – стабилизаторы фермента.

(NH₄)₂SO₄ (1-10%) – улучшает отжиг праймеров.

Все компоненты смешивают в нужном объеме деионизованной воды в специальных пробирках для ПЦР и помещают в амплификатор (или ПЦР-циклер).

Ингибиторы ПЦР – SDS, фенол, этанол, изопропанол, ацетат натрия, хлористый натрий, EDTA, гемоглобин, мочевина.

Цель ПЦР – получить множество одинаковых двухцепочечных кусочков ДНК строго определённой длины (обычно не более 2–3 тысяч пар нуклеотидов, т.п.н.). Для этого проводят 20–30 циклов реакции. Каждый цикл состоит из трёх этапов.

Основные этапы ПЦР

Денатурация. Чтобы полимераза могла работать, две цепи ДНК-матрицы нужно разъединить. Для этого реакционную смесь нагревают до 95ºС. В таких условиях разрушаются водородные связи между азотистыми основаниями параллельных цепей.

Отжиг (гибридизация) праймеров. На этом этапе праймеры специфично присоединяются к освободившимся цепям ДНК-матрицы с разных сторон копируемого участка 3ˊ-концами друг к другу. Чтобы праймеры могли комплементарно связаться (отжечься) только с нужными участками, при их конструировании необходимо учитывать температуру плавления (Т_m). Это расчётная температура, при которой половина праймеров присоединяется к целевому участку ДНК. Отжиг проводят при температуре на 1–5 °С ниже T_m. Температура отжига зависит от длины и состава праймера (50-70ºС).

Элонгация. На этом этапе фермент ДНК-полимераза последовательно выстраивает цепь ДНК (полимер) из нуклеотидов (мономеров), то есть полимеризует их. Этот этап проводят при 72 °С (оптимальная темп. для работы Taq-полимеразы). Фермент присоединяется к комплексам праймер-матрица и, выхватывая из раствора нуклеотиды, начинает по принципу комплементарности прилаживать их к 3ˊ-концу праймера. Удлинение, или элонгация, новой цепи ДНК идёт с максимальной скоростью 50–60 нуклеотидов в секунду (то есть около 3000 в минуту). Каждая вновь синтезированная цепочка ДНК становится, наравне со старой, матрицей для синтеза в следующем цикле. Таким образом, количество нужного продукта (ампликона) в процессе реакции возрастает в геометрической прогрессии. Через 25–40 циклов количество функциональных молекул полимеразы в реакционной смеси истощается. Чтобы добиться большего выхода продукта, содержимое пробирки можно разбавить и снова использовать для амплификации с уже новыми рабочими компонентами.

Подбор праймеров

– Длина – 18-30 нуклеотидов

– Содержание GC должно составлять 45-55%

– Разница между темп. прямого и обратного праймера должна быть не более 5ºС), иначе он не сядет

– Не должны формировать димеры на 3’ концах

– Не должны формировать шпилек на 3’ конце

Формула для подборки праймеров вручную: T_o = ([A+T] × 2ºС + [G+C] × 4ºС) – 5 ºС).

Программа для проведения ПЦР

95ºС – 2 мин (горячий старт – денатурация)

9

25 – 40 циклов

4 ºС – 30 сек (денатурация)

62ºС – 45 сек (отжиг)

72ºС – 40 сек (элонгация)

72 ºС – 3-5 (конечная элонгация)

Эффект выхода на плато

– Истощение субстратов (дезоксинуклеотидтрифосфатов) и праймеров

– Падение активности дезоксинуклеотидтрифосфатов и фермента

– Накопление ингибиторов, например, пирофосфатов и ДНК-дуплексов

– Конкуренция за реагенты неспецифическими продуктами или праймер-димерами

– Концентрация специфического продукта: неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации

Метод ПЦР имеет два недостатка. Первый: используя ПЦР, нельзя клонировать достаточно протяжённые фрагменты ДНК. Во-вторых, система in vitro не защищена от ошибок, которые допускают любые полимеразы в процессе матричного синтеза ДНК ( TagДНК-полимераза 2-3 нуклеотида на каждые 10 тыс. п.н.), эти ошибки, воспроизводясь с каждым циклом ПЦР, накапливаются вместе с целевым фрагментом.

20. Клонирование ДНК in vivo. Векторы для клонирования (клонирующие векторы). Необходимые свойства клонирующих векторов. Основные этапы клонирования in vivo.

Клонирование ДНК in vivo – это клонирование с использованием живой системы вирусов, клеток микроорганизмов, чаще всего Е. соli, и дрожжей; в англоязычной лит-ре такие клоны ДНК чаще называют искусственными хромосомами, соответственно virus, bасteria artificial chromosome и yast artificial chromosome, сокращенно VАС, ВАС и YАС).

Векторы – устройства для доставки, клонирования и экспрессии чужеродных генов с помощью живых систем.

Вектор – молекула ДНК, способная самостоятельно реплицироваться в клетках различных организмов и обеспечить размножение (клонирование-векторы для клонирования) и работу (экспрессию генов-экспрессионные векторы) встроенного в неё искусственно какого-либо гена.

Векторы для клонирования (клонирующие векторы)

Плазмида – автономно (независимо от основной хромосомы) реплицируемая внехромосомная кольцевая молекула ДНК, существующая у многих видов бактерий. Специально созданные для молекулярного клонирования плазмиды невелики (несколько килобаз величиной) и содержат три обязательных компонента: ориджин для репликации (копирования в кишечной палочке или в дрожжах), один или более избирательных маркеров (например, ген, определяющий устойчивость к антибиотикам) и один или более сайтов рестрикции, которые могут быть использованы для удаления чужеродной ДНК.

Плазмидно-вирусные векторы:

Космида – гибридная автономная реплицирующаяся плазмида, содержащая фрагмент ДНК фага, включая cos-сайт (необходимый для упаковки в вирионы фага лямбда) / смесь плазмиды с вирусной РНК, рекомбинантная плазмида.

Фазмида – гибридный линейный молекулярный вектор, концы которого – сегменты ДНК фага λ, содержащие все гены, необходимые для литической инфекции, а средняя часть – линеаризованная плазмида.

Вирусные векторы (фаг λ, М13 и др).

Бактериальная искусственная хромосома (BAC) – векторная система на основе F-плазмиды (кодирует гены, регулирующие репликацию и контролирующие количество копий), cos-сайтов фага λ и lox-фага P1, используемая для клонирования длинных (150-350 т.п.н.) последовательностей ДНК. F-плазмида (1-2 молекулы на клетку).

Дрожжевая искусственная хромосома (YAC) – кольцевая рекомбинантная молекула ДНК, содержащая отдельные генетические элементы дрожжевого генома, которые позволяют ей существовать во внехромосомном состоянии в клетках дрожжей.

Необходимые свойства клонирующих векторов

Вектор должен:

иметь небольшой размер и достаточную ёмкость

нести нуклеотидную последовательность, которая отвечает за автономную репликацию данной молекулы в определённом типе клеток

иметь как можно меньшее число мест расщепления определённой рестриктазой (лучше 1 сайт рестрикции). Рестриктаза – «ножницы», ДНК-лигаза – «нитка с иголкой»

содержать полилинкер (синтетическую последовательность ДНК, содержущую много сайтов для рестрикции)

содержать селективные или маркерные гены

обладать способностью к размножению в клетке реципиента с образованием большого числа копий

Вектор не должен:

Терять репликативных свойств даже при встройке чужеродного фрагмента ДНК

Этапы клонирования ДНК in vivo

Выделение нужного (целевого) гена

Встраивание его в генетический элемент (вектор), способный к репликации

Введение вектора в организм-реципиент

Идентификация (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены)