21. Плазмиды. Плазмидные векторы для клонирования in vivo. Методы трансформации плазмидной днк. Скрининг (отбор) трансформированных бактериальных клеток.

Плазмида – короткая кольцевая молекула ДНК, плавающая в цитоплазме бактериальной клетки. Плазмиды не связаны с бактериальной хромосомой, они могут реплицироваться независимо от неё, могут «выплёвываться» бактерией в окружающую среду или, наоборот, из неё «проглатываться». С помощью плазмид бактерии обмениваются друг с другом генетической информацией – например, передают соседям устойчивость к какому-нибудь антибиотику. Плазмиды существуют внутри бактерий в естественных условиях. Они также искусственно синтезируются исследователями, наделяются нужными свойствами, в них вшивают вставки (одна или несколько) и запускают в клетку.

Плазмида PBR32 (длина – 4361 пар нуклеотидов) –  ранее самая популярная, потом стала основой для плазмид нового поколения. В ней есть участок начала репликации (ori), благодаря которому она может размножаться в клетках бактерии E. Coli; гены устойчивости к двум антибиотикам – ампициллину (amp) и тетрациклину (tet); сайты рестрикции Pst I, Bam HI и Sal I. Однако, при всей своей надёжности и соответствии всем необходимым для векторов требованиям, этот вектор имеет мало удобных сайтов для клонирования + отбор трансформированных клеток в экспериментах с рекомбинантными ДНК на его основе занимает много времени.

Возникла необходимость разработки более совершенных, систем клонирования. Так была создана группа векторов семейства pUC. (UC –University of California). Исследователи создали серию векторов, имеющих важную черту – наличие в структуре ДНК встроенного синтетического полилинкера, т.е. последовательность нуклеотидов, составленную из сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции, уникальных для данного вектора.

Плазмидный вектор pUC 19 (длина – 2686 нуклеотидных пар) содержит:

точку начала репликации (ori)

ген устойчивости к ампициллину (Amp)

регулируемый сегмент β-галактозидазы (lacZ) лактозного оперона E. Coli

ген lacI, кодирующий репрессор, который контролирует экспрессию гена lacZ

полилинкер (краткую последовательность с множеством уникальных сайтов для рестрикционных эндонуклеаз: (EcoRI, SacI, КрпI, ХmаI, SmaI, BamHI…)

Присутствие в плазмиде pUC19 гена, обеспечивающего устойчивость к ампициллину, позволяет отбирать клоны E.coli, содержащие данный вектор или рекомбинантные ДНК на его основе на питательных средах с этим антибиотиком.

Трансформация E. Coli плазмидной ДНК: плазмидные вектора вводят в реципиентные клетки методом генетической трансформации. Компетентные клетки – бактериальные клетки, способные к трансформации.

Основные этапы процесса бактериальной трансформации

Подготовка компетентных клеток

Трансформация

Восстановление клеток

Посев клеток

В естественных условиях бактериальные клетки не способны к поглощению ДНК. Это связано, прежде всего, с прочной клеточной стенкой, состоящей из пептидогликанов, которую имеет клетка E.coli, а также с отрицательным зарядом её внешней мембраны, в состав которой входят фосфолипиды и липополисахариды. Поскольку молекула ДНК также заряжена отрицательно, ее проникновение в бактериальную клетку становится проблематичным по механическим и электростатическим причинам. Для решения этой проблемы были разработаны методы трансформации.

Методы трансформации: трансформация E. Coli

Метод замораживания-оттаивания. Это непродолжительное замораживание компетентных бактериальных клеток совместно с плазмидной ДНК при -70ºС и последующее оттаивание при 37 ºС. Клетки при этом обрабатывают раствором бивалентных катионов (Ca²⁺, Mg²⁺, Rb⁺, Mn ²⁺). Это приводит к снижению общего отрицательного заряда поверхности бактериальной клетки и к уменьшению подвижности фосфолипидного бислоя. Поглощение ДНК происходит очень быстро в присутствии CaCl₂.

Метод электропорации. Проникновение ДНК в бактериальную клетку происходит под действием электрического поля при высоком напряжении в течение краткого времени. Условия электропорации (напряжённость поля и длительность импульса) могут требовать предварительной оптимизации. Подготовка клеток не требует обработки их ионами двухвалентных металлов, но необходимо несколько раз промыть их стерильным раствором 10% глицерина от солей, содержащихся в питательных средах. Электропорацию проводят в электропораторах в специальных кюветах. Метод электропорации используют, когда работают с плазмидами с молекулярной массой выше 10 kb, когда необходимо сделать котрансформацию двух или трех плазмид, а также при работе с библиотеками ДНК, требующих большого количества трансформаций.

Применение репортёрных генов для создания трансформированных клеток (какие гены, входящие в состав плазмидного вектора, позволяют производить отбор?)

Ген lacZ кодирует фермент β-галактозидазу. β-галактозидаза расщепляет лактозу на галактозу и глюкозу. Для выявления β-галактозидазной активности используют X-gal. Это бесцветное вещество, которое превращается в окрашенное 5,5-дибромо-4,4-дихлороиндигобетагалктозидазой. Синее окрашивание можно наблюдать на среде с X-gal при культивировании бактерий, экспрессирующих ген lacZ.

Советую почитать: https://biomolecula.ru/articles/metody-v-kartinkakh-polimeraznaia-tsepnaia-reaktsiia (19)

https://biomolecula.ru/articles/molekuliarnoe-klonirovanie-ili-kak-zasunut-v-kletku-chuzherodnyi-geneticheskii-material (20, 21)