16. Рекомбинантная днк. Инструментарий для создания рекомбинантных молекул днк.

Рекомбинантная ДНК — молекула ДНК, полученная в результате объединения in vitro чужеродных (в природе никогда вместе не существующих) фрагментов ДНК с использованием методов генной инженерии.

Рекомбинантная ДНК (recombinant DNA): ДНК , полученная в результате объединения молекулы векторной ДНК , способной к репликации в определенной клетке-хозяине , с ДНК, кодирующей продукт, синтез которого желательно осуществить в этой клетке-хозяине. Векторы для получения рекомбинантных ДНК могут быть плазмидами, вирусами или искусственными хромосомами на основе дрожжевых или животных хромосомных элементов. Существует большой набор различных систем, позволяющих осуществлять экспрессию гетерологичных генов в бактериях, дрожжах и других организмах, включая клетки человека.

Создаваемые генными инженерами рекомбинантные ДНК называют также химерными. Они были созданы для самых разнообразных целей, в том числе и для целенаправленого воздействия на ВИЧ. Число научных работ в этом направлении очень велико.

Для получения рекомбинантной ДНК плазмиды выделяют из Е. coli и удаляют из них часть кольцевой молекулы ДНК. Для этого применяют рестриктазы. Комплементарные цепи молекулы ДНК разрезаются в разных местах, в результате чего образуются «липкие» концы — неспаренные участки цепей, способные присоединять комплементарные им полинуклеотиды. На фрагменте ДНК, выбранном для пересадки, тоже создают «липкие» концы, используя ту же рестриктазу, и, следовательно, на фрагменте ДНК образуются «липкие» концы, комплементарные «липким» концам рестриктированной плазмиды. Если теперь смешать фрагмент ДНК (ген) и плазмиду, то они соединятся «липкими» концами.

Техника генной инженерии включает несколько последовательных процедур:

1. выделение нужного (целевого) гена;

2. встраивание его в генетический элемент, способный к репликации (вектор);

3. введение вектора в организм-реципиент;

4. идентификация (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены.

Технология рекомбинантных ДНК оказала существенное воздействие на развитие современной биологии, позволив решать многие теоретические задачи, например, определять функции белков, изучать механизмы регуляции экспрессии генов. Затем с помощью фермента лигазы образуют фосфодиэфирную связь между концевыми нуклеотидами обеих молекул, и вновь получают кольцевую молекулу ДНК, но теперь она вместе с плазмидной ДНК содержит ген, выбранный для пересадки. Это и есть рекомбинантная ДНК, т. е. ДНК, содержащая новую комбинацию последовательностей (или генов), такую, какой прежде в природе не было.

Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько групп:

- ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);

- ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);

- ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);

- ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.