Вопрос 8

Репликоны прокариот и Эукариот

Участок ДНК, на котором синтезируется отдельный фрагмент лидирующей нити, называется репликоном. У многих прокариот их геном содержит только одну точку инициации репликации, то есть у них в ДНК только один репликон. Эукариотические геномы полирепликонны.

Место начала репликона, в котором происходит инициация репликации, носит название ориджина репликации. Именно ориджин распознается специальными белковыми комплексами и на нем начинается формирование вилки репликации.

1) Продолжительность клеточного цикла у эукариот варьирует от 10 мин до 200 часов. Поэтому и продолжительность репликации у эукариот больше, чем у прокариот.

2) Роль точек инициации репликации прокариот (ориджинов) у эукариот выполняют автономно реплицирующиеся последовательности (ARS). С этими автономно реплицирующимися последовательностями связываются специальные белки, инициирующие процесс репликации.

3) Размеры репликонов у эукариот значительно меньше, чем у прокариот, хотя в пределах генома одного вида они могут варьировать десятикратно

4) В клетках прокариот фрагменты Оказаки синтезируются длиной от 1000 до 2000 нуклеотидов. У эукариот они значительно короче – от 100 до 200 нуклеотидов.

5) Скорость синтеза ДНК у прокариот в области репликационной вилки (1000 нуклеотидов/с) на порядок выше, чем у эукариот (около 100 нуклеотидов/с). Высокую скорость репликации обеспечивает указанные выше ферменты – геликаза, топоизомераза, дестабилизирующие белки, ДНК-полимераза, РНК-праймаза, ДНК-лигаза и др., совместно действующие в области репликативной вилки (рис. 2.25). Вместе с тем, меньшая скорость репликативного синтеза у эукариот объясняется большей степенью конденсации (упаковки) ДНК в хромосомах, а также более сложной и тщательной «проверкой» правильности синтезируемой дочерней цепи специальными репарирующими системами.

Репликация молекул ДНК у прокариот протекает несколько иначе, чем у эукариот. У прокариот одна из нитей ДНК разрывается и один конец ее прикрепляется к клеточной мембране, а на противоположном конце происходит синтез дочерних нитей. Такой синтез дочерних нитей ДНК получил название «катящегося обруча».

Скорость репликации

В хромосомах эукариот репликационные вилки движутся со скоростью около 50 нуклеотидов в секунду. Это в 10 раз меньше, чем у бактерий, что, возможно, связано с большей трудностью репликации ДНК, упакованной в хроматин.

Вопрос 9

Ферменты репликации

Процесс репликации осуществляется сложным ферментным комплексом, насчитывающим 15-20 различных белков.

Первым начинает действовать фермент геликаза (от helix - спираль). Он обеспечивет расплетение двойной спирали родительской ДНК путем разрыва водородных связей между нуклеотидами. На это затрачивается энергия гидролиза АТФ – по две молекулы на разделение 1 пары нуклеотидов. У эукариот одновременно происходит вытеснение данного участка ДНК из связи с гистонами и другими хромосомными белками.

Однако расплетение спирали на некотором участке создает суперспирализацию перед этим участком, так как каждая молекула ДНК некоторыми участками зафиксирована на ядерном матриксе. Поэтому она не может свободно вращаться при какого-то своего участка. Это и вызывает суперспирализацию, что препчтствует дальнейшему расплетению цепи.

Эта проблема решается с помощью ферментов топоизомераз. Существует два типа топоизомераз (топоизомераза типа I и топоизомераза типа II). Топоизомераза I разрывает одну из цепей ДНК, и переносит один свободный конец на себя. Это позволяет участку ДНК от места расплетения до места разрыва вращаться вокруг целой цепи, что предупреждает образование супервитков. Впоследствии концы разорванной цепи вновь замыкаются. Топоизомераза II разрывает обе цепи ДНК, перенося соответствующие концы на себя. Это позволяет более эффективно решать проблему суперспирализации при расплетении ДНК.

После расплетения двойной спирали хеликазой, с каждой из двух нитей связываются специальные SSB-белки. Они обладают повышенным сродством к одноцепочечным участкам ДНК и стабилизируют их в таком состоянии. Механизм действия основных ферментов репликации ДНК-полимераз таков, что синтез новой полинуклеотидной цепи не может начаться с включения в нее первого нуклеотида. Синтез идет только как удлинение уже существующего полинуклеотида, который комплементарен матрице и образует с ней двуспиральный комплекс матрица-затравка. Во всех живых системах такой затравкой служит не ДНК, а короткая РНК. РНК-затравка синтезируется ферментом праймазой (или РНК-полимеразой).

Рост цепей ДНК осуществляется ферментами ДНК-полимеразами. Удлиннение цепи ДНК (или отдельного ее фрагмента) всегда происходит в направлении от 5’-конца к 3’-концу. Это означает, что очередной новый нуклеотид присоединяется к 3’-концу растущей цепи.

Для завершения репликации (терминации) используются ферменты лигаза и теломераза.

В результате действия предыдущих ферментов новосинтезированная запаздывающая цепь оказывается состоящей из фрагментов, вплотную примыкающих друг к другу (кроме кольцевой ДНК). «Сшивание» соседних фрагментов осуществляется ДНК-лигазой (фермент образует фосфодиэфирную связь). Для осуществления реакции требуется гидролиз АТФ.

ДНК-полимеразная система оставляет недореплицированными 3’-концы материнских цепей ДНК, т.е. новые цепи оказываются укороченными с 5’-концов. Эта проблема решается при помощи фермента теломеразы. Теломераза удлинняет не новую, укороченную цепь, а старую, более длинную. К 3’-концу старой (родительской) цепи теломераза последовательно пристраивает несколько сотен повторяющихся последовательнотей. После чего значительно удлинненная старая цепь становиться способной выступать в качестве матрицы для образования еще одного фрагмента Оказаки новой (укороченной) цепи. Таким образом восстанавливается длина теломерного участка.

Лидирующая и отстающая цепи

Каждая цепь материнской ДНК служит матрицей для синтеза дочерних молекул. На одной цепи синтез осуществляется непрерывно в направлении от 5' к 3' концу. Эта цепь называется лидирующей. Вторая цепь с противоположной направленностью, называемая отстающей, синтезируется в виде отдельных фрагментов, которые затем сшиваются лигазами в непрерывную молекулу. Фрагменты названы по имени американского ученого Р. Оказаки, впервые постулировавшего такой способ синтеза ДНК, фрагментами Оказаки. В ходе синтеза репликативная вилка перемещается вдоль матрицы, и при этом новые участки ДНК последовательно расплетаются до тех пор, пока вилка не дойдет до точки окончания синтеза (точка терминации).

10. ДНК-зависимые РНК-полимеразы прокариот (на примере Е. сoli) и эукариот. Участие РНК-полимераз в транскрипции различных клеточных РНК.

РНК-полимераза — фермент, осуществляющий синтез молекул РНК. Эти полимеразы осуществляют синтез молекул РНК на матрице ДНК, то есть осуществляют транскрипцию. Химически РНК-полимеразы являются нуклеотидил-трансферазами, полимеризующими рибонуклеотиды на 3'-конце цепи РНК.

В соответствии с субъединичным составом РНК-полимеразы подразделяются на две группы. К первой группе относятся ферменты, состоящие только из одной субъединицы, среди них – РНК-полимеразы митохондрий и небольших бактериофагов. Эти РНК-полимеразы транскрибируют небольшое число генов простых геномов, и для их функционирования не требуется сложных регуляторных воздействий. Вторую группу составляют сложно устроенные РНК-полимеразы бактерий и эукариот, которые представляют собой многосубъединичные белковые комплексы, транскрибирующие сотни и тысячи различных генов. Такие ферменты во время своего функционирования реагируют на многочисленные регуляторные сигналы, поступающие от регуляторных последовательностей нуклеотидов и белковых факторов.

ДНК-зависимая РНК-полимераза прокариот (1 шт) – 70

Наиболее изученной из бактериальных ферментов является РНК-полимераза E. coli. Она осуществляет транскрипцию всех бактериальных генов.

Фермент состоит из пяти субъединиц: бета', бета, двух альфа и сигма. Комплекс из четырех субъединиц бета-бета'-альфа-альфа, часто обозначаемый буквой Е (enzyme), образует так называемый минимальный (кор-) фермент E.coli, который способен осуществлять все основные этапы транскрипции, за исключением правильной инициации. Для инициации транскрипции требуется присутствие определенной регуляторной сигма-субъединицы, необходимой для распознавания РНК-полимеразой промоторов бактериальных генов, определяющей специфичность взаимодействия РНК-полимеразы с промоторами и, возможно, последующую изомеризацию комплекса РНК-полимераза–промотор, необходимую для начала синтеза РНК.

Полный фермент, включающий сигма70-субъединицу, часто называют холоферментом и обозначают Есигма70. РНК-полимераза Есигма70 способна транскрибировать большинство (но не все) генов E.coli. В частности, для транскрипции генов теплового шока, оперонов gln или nif требуется включение в состав полного фермента другой регуляторной субъединицы - сигма54 (молекулярная масса 54 кДа) вместо сигма70 с образованием фермента Eсигма54 .

Все четыре субъединицы кор-фермента обеспечивают контакт РНК-полимеразы с промоторами. При этом b‘-субъединица участвует в связывании фермента с ДНК, b-субъединица образует каталитический активный центр, а a-субъединицы обеспечивают правильное взаимодействие фермента с промоторами.

Субъединица			Функция
а (две)	Кор-фермент	Холофермент	Взаимодействие с ДНК и факторами транскрипции
В			Элонгация
В’			Связывание с ДНК
w			Поддержание конформации В’ субъединицы
сигма			Связывание с промотором

ДНК-зависимые РНК-полимеразы эукариот (3 шт) - 80

1) РНК-полимераза 1, синтезирующая высокомолекулярные (18 s, 5.8 s, 28 s) рРНК. (Pol I). Как и большинство других высокомолекулярных полипептидов, большие субъединицы РНК-полимераз содержат хорошо различимые структурные и функциональные домены: дискретные участки полипептидных цепей, несущие конкретную функциональную нагрузку. Клонирование генов соответствующих субъединиц и определение их первичной структуры позволили выявить эволюционно консервативные участки полипептидных цепей и провести мутационный анализ функциональной значимости их отдельных доменов. Для этой цели в полипептидных цепях с помощью направленного мутагенеза заменяли соответствующие аминокислоты и мутантные субъединицы использовали в сборке ферментов из отдельных субъединиц in vitro с последующим анализом свойств таких реконструированных ферментов.

РНК-полимераза I эукариот является большим ферментом, построенным по меньшей мере из 11 субъединиц. Минимальный фермент Pol I содержит два больших полипептида, которые ассоциированы с несколькими малыми субъединицами (от трех до 14 в зависимости от метода очистки. Третья по величине субъединица Pol I мышей, названная PAF53 (polymerase associated factor 53), играет важную роль в узнавании Pol I своих промоторов.

2) РНК-полимераза 2, производящая предшественников для мРНК, а также для большинства мяРНК. Pol II человека содержит более 10 субъединиц, которые трудно назвать субъединицами в обычном смысле из-за слабой ассоциации друг с другом. Некоторые из них принадлежат к основным факторам транскрипции (GTFs – general transcription factors). Вообще же понятие холофермента Pol II эукариот не является устоявшимся. Лишь недавно было установлено, что некоторые основные факторы транскрипции уже находятся в комплексе с РНК-полимеразой до ее включения в прединициационный комплекс. В состав холофермента Pol II дрожжей входят по меньшей мере 14 белков и белковых комплексов.

Субъединичное строение РНК-полимераз разного происхождения отражает их функциональную роль в акте транскрипции. Действительно, все РНК-полимеразы простого строения транскрибируют узкоограниченный круг генов или небольшие части генома, что имеет место, например при синтезе РНК-затравок для фрагментов Оказаки в процессе репликации ДНК у бактерий. Промоторы, узнаваемые РНК-полимеразами простого строения, не отличаются разнообразием и обладают простой структурой. Показательно, что при сложном строении генома четных T-фагов, в процессе развития которых происходит многократное переключение транскрипции с одних групп генов на другие, используется сложная РНК-полимераза бактерии-хозяина, а не индуцируется простой фермент, как это имеет место у бактериофага T7.

РНК-полимеразы бактерий и эукариот должны, во-первых, узнавать разные промоторы, во-вторых, реагировать на различные белки-регуляторы и, в-третьих, изменять специфичность узнавания последовательностей нуклеотидов матричных ДНК под действием разнообразных белковых эффекторов. Отсюда следует, что у живых организмов, начиная с бактерий, возникает потребность в РНК-полимеразах сложной структуры, способных осуществлять обширную программу реализации генетической информации. Вероятно, поэтому наблюдается иерархия в степени сложности строения указанных ферментов, которая достигает верхнего предела в случае РНК-полимераз эукариот.

3) РНК-полимераза 3, синтезирующая все тРНК, 5s рРНК и ряд низкомолекулярных РНК (нмРНК).

Транскрипция – это процесс синтеза РНК на матрице ДНК, происходящий во всех живых клетках. Этапы транскрипции: Инициация (узнавание ДНК-промотора и сборка РНК-полимеразы), элонгация (синтез пре-мРНК), терминация (остановка синтеза пре-мРНК, распад РНК-полимеразы).

Инициация транскрипции у прокариот

Регуляция инициации транскрипции у прокариот

Транскрипция инициируется при образовании стабильного комплекса между холоферментом РНК-полимеразы и специфичной последовательностью в ДНК – промотор. Промотор располагается в начале всех транскрипционных единиц. Состоит примерно из 40 пар нуклеотидов и расположен непосредственно перед участком инициации транскрипции. В нем различают 2 важных последовательности: Состоит из 6 или 7 нуклеотидов (чаще ТАТАТА) и расположена на расстоянии примерно 10 нуклеотидов от первого транскрибируемого нуклеотида. В данном сайте РНК-полимераза связывается с ДНК. Расположена на расстоянии 35 нуклеотидов и служит участком распознавания промотора РНК-полимеразой.

Оперон – группа генов, транскрибируемых в составе одной РНК: регулируются совместно и обычно обладают общей функцией.

Инициация транскрипции у эукариот	Регуляция инициации транскрипции у эукариот	Регуляция транскрипции у эукариот
ТАТА белок (блок Хогнесса) -25 СААТ белок -70, 80	Множественность РНК-полимераз. Для инициации транскрипции каждая из этих РНК-полимераз должна присоединиться к соответствующим промоторным последовательностям на ДНК. Воздействие на общие и специфические факторы инициации. И варьирование их комбинаций (за счет изменения активности каждого фактора или за счет создания уникальных сочетаний белковых факторов, как общих, так и специфических). Изменение структуры хроматина. Метилирование ДНК, регуляция гистонами и другими белками. Действие энхансеров и сайленсеров.	Энхансер – последовательность ДНК, которая после связывания с ним факторов транскрипции стимулирует транскрипцию с промотора гена. Могут находиться внутри интронов, на другой хромосоме, как в 5’ так и в 3’ положении относительно матричной цепи регулируемого гена и в любой ориентации к ней. Сайленсер – последовательность ДНК, с которой связываются белки-репрессоры (факторы транскрипции), приводит к понижению или полному подавлению синтеза РНК-полимеразой. Сайленсеры могут находиться на расстоянии до 2500 пар нуклеотидов от промотора.