Лабораторная диагностика

Материал дляисследования– промывные воды желудка, испражнения, моча, рвотные массы, остатки пищи.

Цель исследования - обнаружение идентификация возбудителя и токсина.

Бактериологическое исследование

- Выделение Clostridiumbotulinum идентификацию проводят по обычной для анаэробов схеме

(смотри бактериологическое исследование газовой гангрены).

Обнаружение ботулинического токсина

Биологическая проба на мышах

Берут 5 мышей. Одну заражают только исследуемом материалом или фильтратом полученной культуры, а остальных сммью материала с 200 АЕ антитоксической сывороткой соответствующего типа – А, В, С, Е.

Смеси выдерживают предварительно при комнатной температуры 40 минут для нейтрализации токсина.

При наличии в материале ботулотоксина погибают все мыши, кроме тоой, котоой ввели смесь материла с соответствующей типоспецифической сывороткой, которая нейтрализовала действие токсина.

РПГАс антительнымдиагностикумом, ПЦР, ИФА.

Возбудитель газовой гангрены

Таксономия

Семейство Bacillaceae, род Clostridium, виды С. perfringens, С.novyi, С.septicum, С.histolyticuт, С.sordellii, С difficile, С sporogenes.

С. perfringens

Морфологические и тинкториальные свойства

Нормальный обитатель кишечника человека и животных. Толстая неподвижная грамположительная палочка со слегка закруглёнными концами диаметром 0,9-1,3 мкм. Споры овальные, располагаются чаще центрально. образуют капсулу.

Культуральные свойства

Температурный оптимум 45ºС.

На кровяном агаре образуют зону гемолиза, в столбике сахарного агара образуются дисковидные колонии.

На плотных средах бактерии образуют S- и R-колонии. S-колонии круглые, сочные, куполообразные, с гладкими ровными краями. Сначала они прозрачные, позднее становятся мутными, серовато-белыми. R-колонии неправильной формы, бугристые, с неровными шероховатыми краями; в глубине агара напоминают комочки ваты.

На агаре Цейсслера через 12-18 ч образуют гладкие сероватые колонии с ровными краями и плотным возвышением в центре. Колонии окружены зоной гемолиза; гемолиз может быть полным либо частичным. Характерное свойство колоний С. perfringensтипа А, служащее дифференцирующим признаком. - способность менять серовато-белый цвет на зеленовато-оливковый после кратковременного пребывания в аэробных условиях.

На желточном агаре бактерии образуют колонии, окружённые зоной перламутрового преципитата (фосфорилхолин), образующегося из лецитина куриного желтка под действием лецитиназы.

Рост в жидких и полужидких средах. Культуры С. peifringens типа А имеют характерный запах масляной кислоты. Оптимум pH 7,2-7,4, но могут расти в интервале 5,0-8,5.

На средах, содержащих глюкозу, рост происходит очень бурно с образованием Н₂ и СО₂, и заканчивается через 8-12 ч.

Первые признаки роста на среде Китта-Тароцци могут проявляться уже через 1 —2 ч (особенно при 43 °С) и проявляются помутнением и появлением пузырьков газа из-под кусочков печени при встряхивании.

Биохимические свойства

Ферментирует также лактозу, мальтозу сахарозу с образованием кислоты и газа, не окисляют маннит.

Молоко створаживают через 3-5 часов образованием рыхлого сгустка отделением прозрачной сыворотки (с образованием крупноячеистого губчатого сгустка, напоминающего пену на волнах. Это феномен известен как «штормовая реакция»). Разжижает желатин.

Восстанавливает нитраты, расщепляет лактозу, образовывает лецитиназу.

Антигенная структура

6 сероваров (A-F).

Факторы патогенности

• Экзотоксин– гемотоксическое, нейротоксическое, некротическое, Лейкотоксическое и летальное действие:

• α-Токсин (лецитиназа С).Продуцируют все типы С. peifringens, но наиболее интенсивно тип А. Проявляет дерматонекротизирующее, гемолитическое и летальное (убивает лабора­торных животных при внутривенном введении) действие.

• β-Токсин. Основные продуценты — бактерии типов В и С. Проявляет некротизирующее и ле­тальное действие; гемолитического действия не оказывает. Invivoвызывает развитие некротических энтеритов;

• δ-Токсин. Основные продуценты — бактерии типов В и С. Проявляет летальное действие и гемолитическую активность (лизирует эритроциты барана, но не эритроциты кролика или лошади).

• θ-Токсин. Основной продуцент — С. peifringensтипа С; бактерии типов А, В, Dи Е образуют его в меньших количествах. Проявляет дерматонекротизирующее, летальное действие и гемолитическую активность (разрушает эритроциты барана и лошади),

• ε- и ι-Токсины. ε-Токсин продуцируют бактерии типов В и D, ι-токсин — бактерии типа Е.Проявляют летальное и дерматонекротизирующее действие.

• к-Токсин (коллагеназа и желатиназа). Продуценты — бактерии типов А, С, Е и некоторые штаммы типа D. Разрушает ретикулярную ткань мышц и коллагеновые волокна соединитель­ной ткани. Оказывает летальное и некротизирующее действие.

• λ-Токсин (протеиназа).Проявляет активность экзоэнзима, обусловливающего некротичес­кие свойства. Расщепляет денатурированный коллаген и желатину; во многом напоминает действие фибринолизина.

• γ- и η-Токсины. Оказывают летальное действие на лабораторных животных; их биохимическая природа остаётся неизвестной.

• μ- и ν-Токсины (гиалуронидаза и ДНКаза).μ-Токсин ответственен за повышение проница­емости тканей. ν-Токсин расщепляет нуклеиновые кислоты, тем самым нарушая реакции белкового синтеза.

• Энтеротоксин. Продуценты — бактерии типов А и С, вызывающие пищевые токсикоинфекции. Термолабильный протеин, образующийся при споруляции бактерий в толстой кишке. Вызывает рвоту и диарею, оказывает летальное действие, а также обусловливает появление эритематозной кожной сыпи у лабораторных животных. Диарея развивается вследствие потери воды и электролитов за счёт дилатации и повышения проницаемости капилляров.

Патогенез и клиническая картина

Микроорганизмы, а чаще их споры могут быть занесены в рану из внешней среды, а также с кожи или из ЖКТ пациента.

Газовая гангрена:

• обширное отслоение кожных покровов,

• распад мышечной ткани,

• кровянистый экссудат,

• пузырьки газа в подкожной клетчатке,

• мышцы дряблые и имеют вид вареного мяса,

• образование газа с гнилостным запахом.

Пищевые токсикоинфекции:

С. petfringensтипа А вызывает преимущественно токсикоинфекциилёгкой и средней степени тяжести. Заболевания развиваются остро, с болями в животе, рвотой (иногда с примесью крови) и диареей (до 20 раз в сутки). Симптомы исчезают в последующие 12- 24 ч. Летальные исходы наблюдают редко, обычно у ослабленных пациентов — пожилых лиц, хронических больных и детей с нарушениями питания.

С. petfringensтипа С вызывает некротический энтерит. При острых формах болезнь может закончиться смертью пациента в течение 12-24 ч. Симптомы аналогичны поражениям, вызываемым бактериями серовара А, и обусловлены действием -токсина.

С.novyi

Грамположительная полиморфная толстая палочка, диаметром0,8-1,4

мкм,могут располагаться в виде цепочек. Капсул не образует, перитрих. Споры овальные и располагаются субтерминально. Строгий анаэроб. Температурный оптимум 40-45ºС.

На среде КиттаТароцци растет помутнение дает большой осадок. Наблюдается умеренная ферментация глюкозы с образованием газа. Молоко свертывают медленно, разжижает желатин. На кровяном агареобразует серые, бугристые колонии с приподнятым центром и зоной гемолиза. В столбике сахарного агарадает хлопьевидные

колонии. Ферментирует глюкозу, мальтозу и не ферментирует лактозу.

Патогенность связана с экзотоксином, который оказывает такое же действие, что и при заражении С. perfringens.

По антигенной структуре выделяют₃ типа - А, в, С

C.septicum

Тонкая длинная полиморфная палочка, диаметром 1,1-1,6 мкм грамположительная. Споры располагаются субтерминально или центрально. Капсулы не образует, перитрихи.

На среде Китта-Тароцци растет в виде помутнения. Наблюдается ферментация глюкозы с образованием кислоты и газа. Молоко свертывают медленно, разжижает желатин.На кровяном агаре образует колонии с тонкими отростками и зоной гемолиза

В столбике сахарного агара колонии имеют вид Пушинок с уплотненным центром. Ферментирует глюкозу, мальтозу, лактозу с образованием кислоты и газа, не ферментирует маннит и сахарозу.

Продуцирует экзотоксин, обладающий гемотоксическим, некротоксическим и летальным действием.

C.histolyticum

В природе встречается в почве, веточных водах, иногда в кишечнике.

Прямая палочка диаметром 0,6-1 мкм, перитрих. Капсул не образует. Споры располагаются субтерминально. Углеводы не ферментирует.

На среде Киттз-Тароцци растет в виде помутнения. В столбике сахарного агара колони мохнатые и неправильной формы. На кровяном агаре колонии мелкие, прозрачные, как капельки росы с узкой зоной гемолиза. Обладает сильными протеолитическими свойствами - быстро разжижает желатин, свертывает молоко, вызывает протеолиз мягких тканей с обнажением костей и отпадением конечностей. Продуцирует некротоксический и летальный экзотоксины.

C.sordellii

Прямая грамположительная палочка диаметром 1,1-1,6 мкм, иногда образует цепочки, перитрих, капсул не образует, споры располагаются субтерминально или

центрально.

Быстро разжижает желатин, ферментирует глюкозу, левулозу, мальтозу с образованием кислоты и газа. Медленно свертывает молоко.

Температурный оптимум 37ºС.

C.sporogenes

Прямая палочка диаметром 0,3-0,4 мкм, грамположительна, перитрих, капсул не образует, споры располагаются субтерминально.

На среде Китта-Тароцци растет в виде помутнения и газообразованием. Температурный оптимум 30-40ºС.

В ранах вызывает протеолиз мертвых тканей, обусловливая гнилостный запах.

C.difficile

Обнаруживается у 3% здоровых людей в кишечнике.

Палочка диаметром 1,3-1,6 мкм_, грамположительна, перитрих, капсул не образует, споры располагаются субтерминально.

Температурный оптимум 30-37ºС.

На среде Китта-Тароцци растет в виде зернистого осадка. На плотных средах колонии круглые, серовато-белого цвета с матовой поверхностью. На кровяном агаре гемолиза не дает, молоко не створаживает.

Патогенность обусловлена токсическим комплексом из цитотоксина, энтеротоксина и летального токсина.

В 90-100% случаев является возбудителем антибиотикозависимых псевдомембранозных колитов

Эпидемиология

Резервуар инфекции - почва.

Путь передачи – раневой.

Патогенез и клиническая картина

Инкубационный период-до 5 дней.

Формы газовой гангрены:

• Анаэробная инфекция мягких конечностей и туловища.

• Анаэробная инфекция мозга.

• Послеродовая или послеабортная анаэробная инфекция.

• Анаэробная инфекция органов брюшной полости ибрюшины.

• Анаэробная инфекция органов грудной полости.

• Анаэробный остеомиелит.

Для анаэробной инфекции характерны:

прогрессирующий некроз тканей,

отек, газообразование в тканях,

отравление токсинами возбудителя и продуктами рас лада тканей.

Клостридии - некропаразиты, благоприятной средойдля их служат мертвые или поврежденные ткани. Наиболее опасны тяжелые повреждения с обширной раневой поверхностью, нарушением кровообращения, гематомами, размозжением мышц, раздроблением костей и т.д.

Попадая в такие раны, клостридии начинают быстро размножаться и выделять экзотоксин. Они проникают в здоровую ткань, вызывая их некроз.

В патогенном действии клостридии различают 2 стадии:

Образование отека. Вследствие действия токсина повышается проницаемость сосудов для плазмы, клеток крови. Это приводит к сдавливанию тканей и поступлению токсинов.

Развитие газовой гангрены - некроз мышечной и соединительной тканей. Газообразование является результатом активной ферментативной активности клостридииТоксины вызывают некроз тканей и сильнейшую интоксикацию. Чем больше зона поражения, тем сильнее интоксикация.

Иммунитет

Антитоксический ненапряженный иммунитет.

Лечение

— активное хирургическое лечение — широкое вскрытие всех подозрительных участков параллельными (лампасными) разрезами, иссечение нежизнеспособных тканей, дренирование раны, которая должна оставаться открытой. В дно и края ран вводят антибиотики широкого спектра действия. При подтверждении диагноза и распространении гангрены необходима немедленная ампутация или экзартикуляция конечности. Рану после ампутации зашивать нельзя.

— общие мероприятия - интенсивная инфузионная терапия с введением альбумина, плазмы, растворов электролитов и белков. В/в или в/aвводят высокие дозы антибиотиков.

— Противогангренозные антитоксические сыворотки (при выявлении возбудителя - моновалентные, а при не установленном - поливалентные) вводят внутривенно в дозе

150000 АЕ + специфический иммуноглобулин.

Профилактика

ПХО раны с иссечением нежизнеспособных тканей, краёв и дна раны в пределах здоровых тканей, + местная и общая терапия антибиотиками широкого спектра действия.

Активная профилактика — анатоксин.

Пассивная профилактика: противогангренозная антитоксическая сыворотка.

Лабораторная диагностика

Материал для исследования - кусочки пораженный тканей, отечная жидкость, перевязочный материал, почва, испражнения, продукты.

Бактериоскопическое исследование

Из отделяемого раны или экссудата готовят микропрепарат и окрашивают по Граму

Результат - обнаружение грамположительных палочек.

Бактериологическое исследование

1этап

Посевматериала в прогретую в течение 30 минут при 85ºС среду Китта-Тароцци, повторно кипятят и инкубируют от 20 минут до 3-5 часов.

2 этап

Учет результатов в среде Китта-Тароцци по наличию помутнения, осадка и газообразования.

Пересев:

• на сахаро-кровяной агар по методу Цейсслера,

• в столбики сахарного агара по методу Вейнберга.

Инкубация 18-24 часа при 37ºС.

3 этап

Учет результатов на питательныхпо признакам:

Культуральным в зависимости от возбудителя (бело-серые круглые колонии на КСА и рост в виде пушинок, комочков ваты или округлыхзерен на СА).

Обнаружение грамположительных палочек в мазках, окрашенных по Граму.

Наличие гемолиза.

Пересев подозрительных колоний в среду Китта-Тароцци.

Инкубация 18-24 часа при 37ºС.

4 этап

Идентификация чистой культуры следующим признакам:

Обнаружение грамположительных палочек в мазках, окрашенных по Граму.

Биохимические свойства –сахаролитические и протеолитические (в зависимости от возбудителя).

Заражение белых мышей исследуемым материалом или фильтратом бульонной

идентификации токсина (токсигенности) помощью реакции нейтрализации.

Ускоренная диагностика:

РИФ,ПЦР, ИФА.

Посев материала в прогретую среду Китта-Тароцци, Вильсона-Блера и в молоко. Инкубация в термостате 5-6 часов при 37ºС.

В результате: в ср. Китта-Тароцци - помутнение и газообразование, в ср Вильсона-Блера - почернение среды, в молоке - створаживание.