Возбудители бруцеллёза и туляремии

Возбудитель бруцеллеза

Таксономия

СемействоBrucellaceae, родBrucella,виды B.melitensis,B.abortus,B.suis.

Морфологические и тинкториальные свойства

Грамотрицательные. Отличаются выраженным полиморфизмом: в одном препарате (особенно в молодых культурах) наблюдают кокки и удлинённые палочки. Клетки В. melitensis чаще представлены кокковидными формами,

В. abortus и В. suis — палочками с закруглёнными концами. Не имеют спор, неподвижны. Имеют капсулу. В мазках располагаются беспорядочно, нередко в виде скоплений. Легко окрашиваются анилиновыми красителями.

Культуральные свойства

Хемоорганотрофы. Строгие аэробы. Температурный оптимум 37ºС, рН 6,6-7,4. Они требовательны к питательным средам. Посевы обычно проводят на 5% КА (с кровью барана) или печёночный агарХаддльсона.

На твёрдых средах бруцеллы образуют мелкие выпуклые гладкие мутноватые, голубовато-серые с перламутровым оттенком S-колонии.

В процессе диссоциации они формируют шероховатые R-колонии.

В жидких средах дают равномерное помутнение с небольшим осадком, но без пленки на поверхности. Гемолиза не дают, пигмента не образуют. Растут медленно.

Биохимические свойства

Каталаза- и оксидазаположительны(кроме В. ovis и В. neotomae).

Ферментируют глюкозу и арабинозу с образованием кислоты. Восстанавливают нитраты; цитрат не утилизируют; индол не образуют; реакции с метиловым красным и Фогеса-Проскауэра отрицательные, образуют сероводород.

Антигенная структура

Определяют до 15 антигенных фракций; выделяют родовой Аг и видовые поверхностные М- (доминируют у В. melitensis), А- (преобладают у В. Abortus и В. suis)и R- (у шероховатых форм) Аг. Третий поверхностный Аг — термолабильный L-Aг, имеющий сходство с Vi-Аг сальмонелл.

Факторы патогенности

• Капсула - защита от фагоцитоза.

• Эндотоксин.

• Фермент агрессии - гиалуронидаза - фермент инвазии,разрушает гиалуроновую кислоту, ↑ проницаемость слизистых оболочек.

Резистентность

Бруцеллы устойчивы во внешней среде. При 10-13 °С они сохраняются в воде и влажной почве до 5 мес, в молоке — до 9 мес, в сыре — до года. При 70°С они погибают в течение 10 мин, при кипячении— практически мгновенно. Бактерии чувствительны к дезинфектантам.

Эпидемиология

Бруцеллёз — зоонозная инфекция.

Резервуар и источник инфекции — домашние животные (овцы, козы, коровы, свиньи, реже собаки). Человек — вторичный хозяин; заболевания людей (исключая случаи лабораторного заражения) возникают на фоне эпизоотий.

Пути передачи - от животного к животным и человеку бактерии передаются через заражённые фекалии, мочу, молоко и мясо.

Как правило, каждый из патогенных для человека видов бруцелл избирательно инфицирует специфических животных:

В. abortus чаще вызывает бруцеллёз крупного рогатого скота (болезнь Банга),

В. melitensis — коз и овец (иногда кур),

В. suis — свиней.

В РФ заболеваемость людей бруцеллёзом носит профессиональный характер; основные возбудители — В. melitensis и В. abortus.

Патогенез

Возбудитель внедряется в организм человека через повреждённую кожу, слизистую оболочку дыхательных путей и ЖКТ, конъюнктиву. Контактный путь заражения более характерен для овечьего и свиного бруцеллёза.

Из первоначальных ворот бруцеллы распространяются по лимфотоку и депонируются в лимфатических узлах.

В первые 5-10 сут бактерии размножаются в макрофагах регионарных лимфатических узлов (миндалины, заглоточные, подчелюстные, язычные, шейные узлы, лимфоидная ткань подвздошно-слепокишечного отдела кишечника).

Бруцеллы способны переживать внутри фагоцитов, выделяя низкомолекулярные факторы, ингибирующие слияние фагосом с лизосомами. Внутри фагоцитов бруцеллы могут формировать в L-формы и длительно персистировать, что приводит к появлению гранулём. Обратный переход в исходные формы обусловливает рецидив болезни. Из разрушенных макрофагов бруцеллы попадают в кровоток и диссеминируют в печень, селезёнку, почки, костный мозг и эндокард.

В поражённых органах находят очаги некроза, окружённые инфильтратами. В дальнейшем бактерии могут попадать в молочные железы человека и появиться в грудном молоке.

Инфицирование плаценты и тканей плода животных приводит к абортам, однако при бруцеллёзе беременных женщин спонтанные аборты регистрируют не чаще, чем у здоровых. Такое различие обусловлено наличием в плаценте животных ускоряющего рост бруцеллэритритола.

Клиническая картина

Инкубационный период 1-6нед.

Клинические формы бруцеллёза: первично-латентная, остросептическая, первично-хроническая метастатическая, вторично-хроническая метастатическая и вторично-латентная. Болезнь начинается постепенно, иногда остро. Болезнь протекает с длительной лихорадкой, ознобом, потливостью, болями в суставах, мышцах. Среди поражений доминируют нарушения функций опорно-двигательного аппарата, нервной и половой систем. Наиболее характерны полиартриты, полиневриты, орхиты и эпидидимиты. При аэрогенном заражении часто развиваются вялотекущие пневмонии. Практически все формы сопровождаются генерализованнойлимфаденопатией, увеличением печени и селезёнки.

Иммунитет

При бруцеллезе формируется напряженный гуморальный и клеточный постинфекционный иммунитет. Первый проявляется в антителообразовании: в сыворотке крови накапливаются агглютинины (вначале IgM, затем IgG) и опсонизирующие антитела, обладающие протективными свойствами. Клеточный иммунитет проявляется в аллергии замедленного типа (ГЗТ), которая выявляется с помощью кожно-аллергической пробы с бруцеллином, а также в реакции бласттрансформации лимфоцитов и торможении миграции макрофагов. Повторные заболевания практически не встречаются.

Профилактика

Предупреждению бруцеллёза способствует элементарное соблюдение правил личной гигиены и режимаобработки сельскохозяйственной продукции.

В эндемичных очагах козье-овечьего бруцеллёза применяют живую вакцину из штамма В. abortus. Проводят однократную накожную иммунизацию. При отрицательной кожной пробе и отсутствии выработки АТ проводят ревакцинацию. Вакцина реактогенна.

Также предложена химическая вакцина из Аг клеточной стенки. Все доступные вакцины не обеспечивают 100% защитного эффекта. Способность взвеси убитых бруцелл (лечебная вакцина) или ХБВ стимулировать клеточные иммунные реакции используют при лечении хронических поражений.

Широко применяется специфическая иммунотерапия убитой лечебной бруцеллезной вакциной (5—7 внутривенных вливаний в нарастающих дозах 1—2 раза в неделю) или бруцеллина (внутримышечно 2 раза в неделю).

Лечение

Тетрациклины и аминогликозиды (стрептомицин); в тяжёлых и упорных случаях назначают рифампицин.

Антибиотики не действуют на бруцеллы, расположенные внутриклеточно, поэтому их можно назначать только при наличии бактериемии, а при хроническом бруцеллезе они неэффективны.

При острых и рецидивирующих формах назначают бруцеллезный иммуноглобулин.

Лабораторная диагностика

Наиболее распространённый метод –серологический.

Реакция Райта. Реакция становится положительной в начале второй недели. Ставится она так же, как и реакция Видаля, в тех же двукратно уменьшающихся разведениях сыворотки больных, к которым прибавляют бруцеллезный диагностикум, представляющий собой убитую формалином или фенолом и окрашенную генцианвиолетом или метилвиолетом взвесь бруцелл, содержащую в 1 мл 1 млрд микробных тел. Пробирки помещают в термостат на 18 - 20 ч, а затем оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Реакция считается положительной при агглютинации диагностикума в титре 1:200. Поскольку сыворотка больных бруцеллезом содержит групповые антитела к возбудителю туляремии, то для уточнения диагноза ’’бруцеллез” реакцию рекомендуют ставить повторно и при этом учитывать нарастание титра антител.

При ориентировочной оценке наличия агглютининов против бруцелл в сыворотке, для ускорения их выявления или при массовом обследовании вместо реакции Райта, пользуясь микропипетками, ставят упрощенную РА Хаддльсона на стеклянной пластине. Капли сыворотки и антигена смешивают стеклянной палочкой и после легкого покачивания стекла приступают к учету реакции, которая появляется уже в первые минуты в виде мелкозернистого окрашенного агглютината. Наличие агглютинации в 0,08 мл сыворотки оценивается как сомнительная реакция, в0,04 мл - слабоположительная, в третьей или четвертой дозах (0,02 и 0,01 мл) - положительная. Реакция агглютинации, выраженная четырьмя плюсами во всех дозах, оценивается как резко положительная.

РИГА, РСК, РИФ при бруцеллезе становятся положительными в конце второй-третьей недели от начала заболевания. Среди этих и других серологических реакций наиболее простой и легко воспроизводимой является опсонофагоцитарная проба (ОФП) с использованием 4 миллиардной взвеси убитых бруцелл. Считают, что показатель ОФП в пределах 10-24 характеризует слабо положительную реакцию, 25 - 49 - ясно выраженную и 50 - 75 - резко положительную. У здоровых людей цифровой показатель этой реакции, как правило, равен 0 или 1, редко 3-5.

Внутрикожная аллергическая проба Бюрне. Ставят ее на 10 - 15 - 20-е сутки заболевания, вводя внутрикожно в область средней трети предплечья 0,1 мл бруцеллина. При положительном результате на месте введения аллергена через сутки появляются болезненность, краснота и отечность размером 1x1 - 6x6 см. Ввиду того что аллергизация организма сохраняется после перенесенного бруцеллеза в течение многих лет и длительное время бывает положительной у привитых лиц, морбидную реакцию Бюрне необходимо дифференцировать с анамнестическими и прививочными.

Бактериологический метод. Для выделения чистой культуры бруцелл исследуют кровь, пунктат костного мозга, мочу, молоко.

Для выделения гемокультуры бруцелл кровь высевают в первые дни лихорадочного состояния. При отрицательных результатах исследование повторяют, так как бактериемия может продолжаться в течение одного-двух лет. С этой целью из локтевой вены берут стерильно не менее 10 мл крови и засевают по 5 мл в два флакона со 100 мл печеночного или асцитического бульона (pH 7,1 - 7,2) или МПБ с добавлением 1 % глюкозы, 2 % раствора глицерина и антифаговой сыворотки. Для предупреждения свертывания крови к средам прибавляют 0,2 % натрия цитрата. Один флакон для выделения В. abortusпомещают в герметически закрывающийся сосуд с 10% оксидом углерода (IV), поступающим через газомер из баллона. Необходимую концентрацию углекислого газа можно получить, закрыв флакон с посевом горящей ватной пробкой, втолкнув ее в горлышко так глубоко, чтобы можно было закрыть его еще резино­вой пробкой и затем залить парафином. Посевы помещают в термостат при 37 °С и, учитывая медленный рост бруцелл, выдерживают до 1 месяца. Через каждые 4-5 суток делают пересевы на печеночный скошенный агар и сухой питательный агар”D”, содержащий дрожжевой аутолизат. При получении мелких изолированных ко­лоний на плотной среде выделяют чистую культуру и определяют вид бруцелл (см. ниже).

Миелокулътуру бруцелл получают путем засева пунктата кост­ного мозга на те же среды. Процент ее высеваемости во много раз больший, чем гемокультуры.

Для выделения уринокультуры асептически полученную катетером мочу центрифугируют, и ее осадок засевают в чашки Петри с печеночным агаром, к которому для задержки роста банальной микрофлоры прибавляют генциан фиолетовый в разведении 1:200 000. Уринокультуры получают в 9 - 14 % случаев.

Аналогично выделяют и лактокулътуру бруцелл. Молоко животных (коз, овец, коров) центрифугируют, и 0,1 - 0,2 мл сливок засевают в чашки Петри с печеночным агаром, содержащим генциан фиолетовый.

Заражение куриных яиц. Наибольшей высеваемости бруцелл достигают при посевах исследуемого материала в желток свежего куриного яйца или в желточный мешок куриного эмбриона. Кровь разводят 1:3 цитратным бульоном и в количестве 0,1 - 0,2 мл вводят в несколько яиц. Зараженные яйца выдерживают в термостате в тече­ние 5 суток при температуре 37 °С, затем 0,3 - 0,5 мл содержимого яиц переносят в плотные и жидкие питательные среды. Посевы исследуют каждые 2-3 суток.

При заражении яиц материалом, содержащим постороннюю микрофлору (испражнения, моча, мокрота, гной и др.), его предварительно центрифугируют. Полученный осадок разводят в 3 - 5 раз раствором генциана фиолетового (1:200 000) и вносят в 3 - 5 яиц по 0,2 мл с последующим пересевом через 5 суток на питательные среды.

Биологический метод. Наиболее восприимч­вы к бруцеллам морские свинки и белые мыши. Кровь больных вводят животным внутрибрюшинно, осадок мочи, сливки - подкожно. Через 20 - 30 суток после заражения у свинки берут кровь и ставят реакцию агглютинации. В это же время животных убивают, вскрывают и кровь из сердца, взвеси внутренних органов и лимфатических узлов засевают на среды.

Дифференциация видов бруцелл.

При росте бруцелл в бульоне происходит его помутнение с последующим образованием слизистого осадка.

В чашках Петри с печеночным агаромбруцеллы образуют мелкие гладкие беловато-мутные колонии с перламутровым оттенком.

Они не ферментируют углеводы, не свертывают молоко и не разжижают желатин. Различные виды бруцелл содержат одинаковые антигены, поэтому идентифицировать их серологическими методами не удается. Бруцеллы дифференцируют по отношению их к углекислому газу, выделению сероводорода и чувствительности к бактериостатическому действию анилиновых красителей.

Схема микробиологического исследования при бруцеллезе

День исследования	Метод
	Бактериологический
	кровь, грудное молоко, желчь, испражнения первые дни лихорадочного состояния.
1 –ый 2 –ой 3 -ий	Посев на печеночный бульон (кровь, молоко) или агар, или в желточный мешок куриного эмбриона. Инкубация в атмосфере с 10% углекислого газа СО2 для выделения (рост 1-4 недели). Изучение характера роста. Микроскопия колоний. Окраска по Граму. Постановка ориентировочной реакции агглютинации на стекле со специфической агглютинирующей сывороткой. Посев на пестрый ряд. Проведение дифференцировки видов бруцеллы по образованию сероводорода, чувствительности к основному фуксину, тионину и определение их потребности в углекислоте. Учет ферментативных свойств. Ответ.
	Серологический. Сыворотка крови с 10-12-го дня.
	Постановка реакции Райта с бруцеллезными диагностикумами. Постановка реакции агглютинации Хеддельсона с концентрированным диагностикумом, окрашенным синькой. Ответ в течение 2-3 мин. Учет реакции Райта. Ответ.
	Аллергический. Внутрикожная проба с аллергином (15-20-день болезни). Введение на ладонную поверхность предплечья 0,1 мл бруцеллина. Учет реакции через 6-8 часов.
	Опсонофагоцитарная проба кровь на 15-20 –й день.
	Биологический
	Заражение мышей или морских свинок в паховую область. Вскрытие через 20-30 дней, проведение бактериологического исследования.

Классификация возбудителя:

Род: Brucella Виды: Br. melitensis (овец и коз) Br. abortus (крупного рогатого скота) Br. suis (свиней) Br. canis (инфекционного эпидидимита баранов)

Восприимчивы многие виды сельскохозяйственных и диких животных, включая человека.

Патогенез и факторы вирулентности:

• возбудитель в организм проникает алиментарным и половыми путями;

• бруцеллы вначале размножаются в ближайших лимфатических узлах, далее проникают во внутренние органы, инфекция принимает генерализованный характер. Наиболее благоприятную среду для размножения бруцеллы находят в беременной матке, что приводит к эндометриту, нарушению питания плода и аборту;

• факторами вирулентности у бруцелл являются эндотоксины и ферменты патогенности – гиалуронидаза, каталаза, уреаза.

Методы диагностики:

1. материал для исследования: абортированный плод с оболочками, желудок, печень, почки плода, молоко и др.

2. Микроскопия:

   • методы окраски: по Граму, по Козловскому;

   • микрокартина: мелкие коккобактерии (0,3-0,6мкм ) или мелкие палочки (0,6-2,5 мкм),  располагаются одиночно, парами и небольшими группами);

   • грамотрицательные;

   • спор не образуют;

   • капсулу не образуют;

   • неподвижные.

3. Культивирование:

   • посев на питательные среды – мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГГА), печеночно-глюкозо-г лицериновый бульон и агар (МГГБ и МГГА) с 10%-ной глюкозой и 2-3% - ным глицерином.

   • особенности выделения возбудителя:

     • микроаэрофилы;

     • выращивают в атмосфере 10-15% СО₂ (Br.bovis, B r.ovis в первой генерации);

     • остальные виды бруцелл – аэробы;

     • оптимальная температура 37^oС;

     • срок культивирования от 15 до 30 дн.

   • культуральные свойства:

     • На жидких средах – равномерное помутнение, пристеночное кольцо, незначительный осадок;

     • На плотных средах – мелкие, прозрачные с ровным краем колонии.

   • биохимические свойства:

     • сахаролитические свойства выражены слабо;

     • протеолитические свойства – молоко не свертывают, желатин не разжижают, сероводород образуют Br. suis в меньшей степени Br. abortus.

4. Биопроба: заражают подкожно морских свинок, белых мышей.

Схема лабораторной диагностики бруцеллеза

Возбудитель туляремии

Таксономия

СемействоFrancisellaceae, род Francisella, виды F.tularensis.

Морфологические и тинкториальные свойства

Грамотрицательные. Мелкие неподвижные капсулированные полиморфные палочки.В мазках из культур доминируют кокковидные формы, в мазках из органов — коккобактерии. Не образуют спор.

Культуральные свойства

Строгие аэробы.Оптимальная температура 36-37°С. Бактерии требовательны к составу питательных сред; культивируют на питательных средах, содержащих цистеин, яичный желток, либо на кровяном агаре с цистеином и глюкозой, хорошо культивируется в желточном мешке курмного эмбриона.

На твёрдых средах образуют очень мелкие колонии в виде капелек беловатого цвета с голубоватым оттенком. Колонии вирулентных штаммов по морфологии и биологическим свойствам соответствуют S-диссоциатам.

В жидких средах размножаются хуже и только у поверхности среды, что связано с аэрофильностью бактерий.

Биохимические свойства

Ферментируют углеводы с образованием кислоты (глюкозу, мальтозу и др.), регистрируемым снижением pH. Каталаза-положительны; индол не образуют, восстанавливают (обесцвечивают) красители — метиленовый синий, малахитовый зелёный и др. В соответствии с распространённостью и биохимическими особенностями выделяют следующие подвиды.

Подвид tularensis.Ферментирует глицерин, содержит цитруллинуреидазу. Тип распространён в Северной Америке; высокопатогенен для человека.

Подвид holarciica.Не ферментирует глицерин, не содержит цитруллинуреидазу. Возбудитель регистрируют в Европе и Азии. Умеренно патогенен для домашних кроликов и человека. Вариант japonica выделяют в Японии; бактерии ферментирует глицерин.

Подвид mediasiatica вызывает заболевания в Средней Азии в дельтах рек Или и Аму-Дарьи. Бактерии ферментируют глицерин. Содержат цитруллинуреидазу. Умеренно патогенны для домашних кроликов и человека.

Антигенная структура

Содержат Vi-антигены и О-антигены, связанные склеточной стенкой.

Факторы патогенности

Капсула и белки наружной мембраны клеточной стенки – факторы адгезии и инвазивности; защита от фагоцитоза.

Эндотоксин

Нейраминидаза -фермент инвазии, разрушает сиаловые рецепторы на поверхности клеток и способствует проникновению микробов по межклеточным пространствам.

Резистентность

В окружающей среде бактерии могут долго сохраняться при низкой температуре, особенно

в зерне и соломе. Они нестойки к высоким температурам и УФ-лучам. При 60 "С гибнут через 5—10 мин, а при кипячении — через 1—2 мин. При 0—4°С сохраняются в воде и фуражедо 6 мес. Чувствительны к большинству антибиотиков (стрептомицин, тетрациклин, левомицетин, эритромицин и др.)- Высокочувствительнык обычно применяемым антисептикам и дезинфектантам (лизол, хлораминубиваютчерез 3—5 мин).

Эпидемиология

Основные источники заражения человека —обыкновенные полёвки, домовые мыши, водяные крысы, ондатры, а также зайцы.

Переносчики инфекции — кровососущие членистоногие: иксодовые и гамазовые клещи, блохи, слепни (оленьи мухи), комары, москиты.

Человек заражается от больных животных, кровососущих членистоногих и объектов окружающей среды.

Пути заражения - контактный (через кожу и слизистую оболочку глаз), трансмиссивный (при укусе пере­носчика), алиментарный (через ЖКГ), аспирационный (через дыха­тельные пути).

Патогенез

После проникновения в организм возбудитель распространяется с током лимфы. Фагоциты активно поглощают F. tularensis, но не способны к их внутриклеточному уничтожению, что создаёт предпосылки для депонирования бактерий в лимфатических узлах. Часть возбудителей погибает, что сопровождается выделением эндотоксина, действующего на лимфатический узел и окружающие ткани. Таким образом, вслед за стадией лимфогенного заноса развивается стадия очаговых реакций и формируются туляремийные бубоны. Последние разделяют на первичные (возникают метастатическилимфогенно и связаны с местом входных ворот) и вторичные (связаны с вторичным заносом из первичного бубона), а также на бубоны первого порядка, второго и т.д., учитывая время их появления. Периодически из сформированных очагов возбудитель проникает в лимфо- и кровоток, что сопровождается выделением новых порций эндотоксина и сенсибилизацией организма. Прорывы бактерий в кровоток могут приводить к метастазированию в печень, селезёнку, лёгкие, костный мозг и другие органы, что обусловливает вторичные поражения (например, вторичную пневмонию, менингит и т.д.).

Клиническая картина

Инкубационный период длится от нескольких часов до 3 нед, в среднем 3—7 дней. Болезнь начинается остро, внезапно, без продрома, с повышения температуры тела до38—39 °С; появляются озноб, резкая головнаяболь, интоксикация. Клиническая картина обусловлена характером пораженныхорганов. Выделяют четыре основные клинические формы туляремии, обусловленные локализацией инфекционного очага: бубонную, лёгочную, генерализованную, желудочно-кишечную.Болезнь протекает длительно (около месяца). Летальность при заражении неарктическим подвидом около 6%, при заражении другими подвидами — 0,1% и ниже.

Иммунитет

После выздоровления развивается стойкий, пожизненный иммунитет.

Лабораторная диагностика

Аллергическая реакция. Аллергизация организма больного возникает спустя 5 дней от начала заболевания. Для ее выявления используют внутрикожную пробу с тулярином или в насечки кожи вводят туаллерген. Результаты аллергических реакций учитывают через 24 - 36 - 48 ч. Обычно на месте введения аллергенов развив­ается выраженная гиперемия и инфильтрат диаметром 5 мм. При этом нужно учитывать, что такая же положительная проба может возникать у реконвалесцентов и вакцинированных против туляре­мии лиц.

Развернутая реакция агглютинации. Высокий титр агглютининов в крови больных обнаруживается к концу второй недели заболевания. Для постановки развернутой РА у больного достаточно взять 2-3 мл крови. Полученную сыворотку последовательно разводят от 1:25 до 1:400. Затем в каждую пробирку добавляют 0,5 мл туляремийного диагностикума, в результате сыворотка разводится от 1:50 до 1:800. Контроль сыворотки и диагностикума ставят, как обычно.