Микробиология и основы биотехнологии

тивный центр фермента. Такими химическими группировками, ответственными за каталитические свойства белка (вступающими в химическое взаимодействие с субстратом), могут быть SH-группа, остатки отдельных аминокислот и др.

Химическая природа простетической группы отдельных ферментов различна. В ее состав могут входить витамины или их производные, различные металлы (Fe, Co, Cu), азотистые основания и др. Установлено, что белковая группа определяет специфические свойства фермента, его избирательную способность действовать на строго определенный субстрат и каталитическую способность активной группы.

Прочность связи простетической группы с белком неодинакова у различных ферментов, вследствие чего она может отделяться от белковой части, вступая во временную связь с другими белками. Такие простетические группы называют коферментами.

Особенностью ферментов является их высокая активность, например, один грамм амилазы (солодового сахара) может превратить в сахар тонну крахмала.

Ферменты отличаются от неорганических катализаторов субстратной специфичностью: каждый фермент взаимодействует только с одним определенным веществом и катализирует лишь одно из превращений, которым может подвергаться данное вещество. Например, фермент каталаза разлагает только перекись водорода с образованием воды и свободного кислорода. Специфичность фермента обусловлена структурными особенностями его молекул и молекул субстрата. По образному выражению Э. Фишера, «субстрат и фермент подходят друг другу, как ключ к замку».

Ферменты отличаются неустойчивостью (лабильностью) к воздействию факторов внешней среды, что объясняется их белковой природой и выражается в потере активности (инактивации).

Влияние экологических факторов на ферментативную активность

Температура. По мере повышения температуры возрастает начальная скорость ферментативной реакции. При достижении известного предела дальнейшее повышение температуры вызывает деструкцию фермента в результате денатурации (лат. denaturare — лишать природных свойств) — свертывания ферментного белка.

61

Температуры, вызывающие денатурацию различных ферментов, неодинаковы. Для термоустойчивых и термофильных микроорганизмов денатурация происходит при 70 °С, для других микроорганизмов — при температуре 40–50 °С. При температуре около 100 °С почти все ферменты полностью инактивируются. В условиях температур, близких к 0 °С, ферментативные реакции замедляются либо приостанавливаются.

Имеются исследования, показывающие, что ферменты сохраняют свою активность в замороженных продуктах. Оптимальная температура, при которой данный фермент активен, не является постоянной величи- ной и зависит от условий, в частности от продолжительности реакции.

Лучистая энергия. Ультрафиолетовые лучи и радиоактивные излу- чения вызывают инактивацию ферментов.

Реакция среды (рН). Исключительно большое влияние на ход ферментативных процессов оказывает реакция среды рН. Для одних ферментов лучшей является слабокислая среда, для других — нейтральная, а для некоторых — слабощелочная. Оптимальное значение реакции среды для некоторых ферментов представлено в табл. 4.1 [9].

Химические вещества. Некоторые вещества повышают активность фермента (активаторы), например NaCI (для слюнной амилазы), а также двухвалентные катионы Ca2+, Mn2+, Ni2+, Mg2+. Активаторами могут служить органические вещества, например витамины. Химические вещества, способные парализовать действие ферментов, называются ингибиторами. К ним относятся соли тяжелых металлов, цианиды, антибиотики, сероводород и др. Ингибиторы связывают химически активные группировки ферментов или входящие в их состав атомы металлов, тормозя или парализуя активность ферментов.

Ò à á ë è ö à 4 . 1

Оптимальные значения реакции среды для некоторых ферментов

62

Концентрация субстрата, т. е. вещества, на которое действует фермент, и концентрация самого фермента также влияют на скорость метаболитических процессов. При избытке фермента и малых концентрациях субстрата скорость ферментативной реакции падает, уменьшение скорости реакции происходит и при избытке субстрата.

Биохимические процессы, протекающие в микробной клетке, регулируются ферментами, поэтому любой фактор среды, действующий на активность фермента, будет оказывать влияние и на микроорганизм. Каждый микроорганизм обладает комплексом разнообразных ферментов, активностью которых определяется его биохимическая деятельность. От спектра ферментов, присутствующих в клетке, зависит избирательность микроорганизмов в отношении питательных веществ, их роль в круговороте веществ в природе и в процессах порчи пищевых продуктов.

Многие ферменты микроорганизмов аналогичны ферментам растений и животных, но некоторые ферменты имеются только у микроорганизмов.

Ферменты, присущие данному микроорганизму и входящие в состав компонентов его клетки, называются конститутивными, а те, которые вырабатываются клеткой только при добавлении к среде вещества (индуктора), стимулирующего синтез данного фермента,— индуцируемыми èëè адаптивными. Например, микроорганизм, не ассимилирующий мальтозу, можно заставить использовать ее, культивируя его в среде с добавлением мальтозы в качестве единственного источника углерода. В этих условиях микроорганизм синтезирует фермент мальтазу, которого не имел ранее.

Ферменты микроорганизмов локализованы в различных клеточ- ных структурах: в цитоплазматической мембране, митохондриях, мезосомах.

Ферменты, выделяемые микроорганизмами в среду, принято называть экзоферментами. Они играют большую роль в подготовке питательных веществ к их поступлению в клетку. Другие ферменты, не выделяющиеся при жизни клетки в окружающую среду, называются эндоферментами (внутриклеточными). Эти ферменты адсорбированы клеточными структурами и участвуют во внутриклеточных процессах обмена веществ. Ферменты после смерти клетки временно остаются в активном состоянии и могут осуществлять автолиз (ãðå÷. autos — ñàì, lósis — растворение), или саморастворение, клетки. При разрушении

63

клеток ферменты поступают в культуральную среду — субстрат, в котором развивались микроорганизмы. Явление автолиза применяют на практике, в частности при получении лекарственных препаратов. В природе явление автолиза происходит в результате старения клетки и изменения в ней ферментативной активности метаболитических процессов.

Классификация ферментов

В настоящее время для многих известных ферментов используется

классификация IUB (International Union of Biochemistró), согласно которой ферменты подразделяются на шесть классов. Класс делится на подклассы, а подкласс — на субподклассы. Каждый фермент имеет порядковый номер внутри своего субподкласса и характеризуется четырьмя цифрами, например, сукцинатдегидрогеназа будет обозначена как КФ 1.3.99.1 (КФ — классификация ферментов).

Классификация ферментов и катализируемые ими реакции представлены в табл. 4.2.

В класс оксидоредуктаз входят многочисленные ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции в процессах дыхания и брожения. Среди них важная роль принадлежит дегидрогеназам —

64

ферментам, катализирующим реакции дегидрогенирования (отщепления водорода) органических соединений. Отнятый водород передается дегидрогеназой другому веществу (промежуточному (временному) или конечному акцептору водорода). В результате одновременно одно вещество окисляется, а другое восстанавливается.

Дегидрогеназы специфичны по отношению к окисляемому субстрату (донору водорода) и к акцептору (приемнику) водорода. Они подразделяются на анаэробные (первичные) и аэробные (вторичные).

Анаэробные дегидрогеназы переносят отнятый от окисляемого субстрата водород другим дегидрогеназам или молекулам органических веществ, но не кислороду воздуха. Эти дегидрогеназы являются двухкомпонентными ферментами. Их простетическая группа при диализе легко отделяется в виде кофермента. Коферментом многих анаэробных дегидрогеназ является никотинамидадениндинуклеотид (НАД). Кофермент, отнимая водород от окисляемого субстрата (А), превращается в восстановленную форму (дегидроформу) — НАД·Н. Передавая водород другому веществу (В), он восстанавливает его, а НАД·Н окисляется (НАД):

ÀÍ2 + ÍÀÄ À + ÍÀÄ·Í2;

ÍÀÄ·Í2 + Â ÍÀÄ + ÂÍ2.

Коферментом других анаэробных дегидрогеназ является никотинамидадениндинуклеотидфосфат. Анаэробные дегидрогеназы имеются как у аэробных, так и у анаэробных микроорганизмов.

Аэробные дегидрогеназы являются двухкомпонентными флавиновыми ферментами, коферментом которых является флавинадениндинуклеотид (ФАД). В состав кофермента входит рибофлавин (витамин В2), который окрашивает флавиновые ферменты в желтый цвет. Одни флавиновые ферменты могут переносить водород непосредственно на кислород, т. е. являются оксидазами (глюкозооксидаза, полифенолоксидаза), другие передают водород от окисляющихся субстратов или восстановленной дегидрогеназы через промежуточных переносчиков к кислороду. Кислород подвергается восстановлению с образованием воды или перекиси водорода:

ÀÍ2 + ÔÀÄ À + ÔÀÄ·Í2,

ÔÀÄ·Í2 + 1/2Î ÔÀÄ + Í2Î;

65

ÍÀÄ·Í2 + ÔÀÄ ÍÀÄ + ÔÀÄ·Í2,

ÔÀÄ·Í2 + Î2 ÔÀÄ + Í2Î2.

Âпроцессах аэробного дыхания важное значение имеет цитохромная ферментативная система, состоящая из цитохромов è цитохромоксидазы. Цитохромная система содержится в клетках всех микроорганизмов, за исключением облигатно-анаэробных бактерий.

Цитохромы представляют собой протеиды, простетической группой которых является железопорфирин — вещество, сходное с гемом гемоглобина крови. Цитохромоксидаза является двухкомпонентным гемосодержащим ферментом, который катализирует окислительно-вос- становительную реакцию между восстановленным цитохромом (последним в цепи цитохромов) и кислородом.

Роль цитохромов в процессе дыхания заключается в последовательном переносе электронов от водородного атома восстановленной дегидрогеназы на цитохромоксидазу.

Âэтом процессе водород от восстановленного кофермента НАД·Н передается на кофермент ФАД флавинового фермента, который восстанавливается (ФАД·Н). С восстановленной флавиновой дегидрогеназы

водород передается на цитохром цитохромной системы. Атом водорода расщепляется на ион водорода (Н+) и электрон (å–), т. к. цитохром способен воспринимать только электроны от атома водорода. В результате этого цитохром из окисленной формы превращается в восстановленную. Восстановленный цитохром передает электроны последующим цитохромам, которые попеременно подвергаются восстановлению и окислению, что связано с изменением валентности железа, содержащегося

âпростетической группе цитохромов. Последний цитохром передает электроны цитохромоксидазе, восстанавливая ее кофермент. Завершающей реакцией является окисление молекулой кислорода восстановленной цитохромоксидазы. Кислород активируется в результате передачи

ему электронов с цитохромоксидазы и приобретает способность соединяться с протонами водорода (Н+), в результате чего образуется вода.

К классу оксидоредуктаз относятся железосодержащие двухкомпонентные ферменты: пероксидаза è каталаза. Пероксидаза катализирует окисление органических веществ с помощью перекиси водорода или органических перекисей. Перекиси действуют как акцепторы водорода. Каталаза непосредственно не участвует в окислительных реакциях, но

66

тесно связана с ними. В процессе дыхания нередко образуется перекись водорода — вещество ядовитое для клетки. Каталаза разлагает перекись водорода на воду и молекулярный кислород.

4.3. Практическое использование ферментов

Применение микроорганизмов в пищевых производствах основано на использовании их ферментативной активности в перерабатываемом пищевом сырье.

Культуры микроорганизмов можно заменить их ферментами в виде препаратов из клеток или культуральной среды. Применение ферментов в пищевой и легкой промышленности позволяет значительно интенсифицировать технологический процесс, повысить выход и улучшить ка- чество готовой продукции.

Для производства ферментных препаратов необходимо иметь сырье, богатое ферментами. Таким исходным сырьем могут служить культуры микроорганизмов, которые по сравнению с клетками растений или животных обладают следующими преимуществами:

–имеют богатый «ассортимент» ферментов, которые могут отсутствовать у животных и растений;

–способны быстро размножаться и давать огромную биомассу кле-

òîê;

–растут на относительно простых и дешевых субстратах (на отходах различных промышленных производств);

–управление развитием микроорганизмов значительно легче, чем выращивание растений и животных.

Отечественное производство микробных ферментных препаратов в последнее время начало интенсивно развиваться. Десятки различных ферментов в виде индивидуальных ферментных белков и технических препаратов разной степени очистки уже производятся в промышленном масштабе с использованием культур бактерий, плесневых грибов, дрожжей.

Препараты грибных амилолитических ферментов применяют в производстве этилового спирта из крахмалсодержащего сырья вместо зернового солода; в хлебопекарной промышленности — взамен солода при изготовлении заварного ржаного хлеба; грибные амилазы добавляют и в пшеничное тесто. В этом препарате кроме амилазы в небольших количествах содержатся мальтаза è протеазы, что ускоряет изготовле-

67

Глава 5 ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН

5.1. Механизмы извлечения энергии клеткой

Клетка способна сохранять весьма специфичное строение только благодаря непрерывному потреблению энергии, иначе она теряет свою структуру и переходит в неупорядоченное и лишенное организации состояние.

Превращение энергии в живой клетке подчиняется тем же законам термодинамики, которые действуют и в неживой природе. Согласно первому закону термодинамики, общая энергия замкнутой системы при любом физическом изменении всегда остается постоянной (E = сonst). Согласно второму закону термодинамики, энергия может существовать в двух формах: свободной (полезной) и рассеянной (бесполезной). В соответствии со вторым законом при любом физическом изменении наблюдается тенденция к рассеиванию энергии, т. е. к уменьшению коли- чества свободной энергии и возрастанию энтропии — величины, характеризующей рассеивание энергии, заключающееся в переходе всех видов энергии в тепловую и равномерном ее распределении между всеми телами природы.

Живая клетка нуждается в постоянном притоке свободной (полезной) энергии, которую получает за счет освобождения энергии химических связей, заключенной в биологическом «горючем» (питательных веществах).

Поскольку клетка функционирует примерно при постоянной температуре, она не может использовать тепловую энергию, чтобы производить работу. Для этого теплота должна переходить от более нагретого тела к менее нагретому. Клетка не может «сжигать» свое «горючее» при высокой температуре, как, например, сгорает уголь при температуре 900 °С. Она не может выдержать воздействие перегрева паром или током высокого напряжения. Ей приходится добывать и использовать энергию не только при постоянной температуре, но и в мезофильных условиях в водной среде при весьма незначительных колебаниях реакции среды (рН).

69

Для того чтобы приобрести возможность получать энергию, клетка на протяжении многовековой эволюции совершенствовала свои молекулярные механизмы регуляции, которые эффективно действуют в «мягких» условиях.

В клетке существует два механизма, обеспечивающие извлечение энергии,— фотосинтез è дыхание. На основании различия в этих механизмах микроорганизмы делятся на два типа. Микроорганизмы, принадлежащие к первому типу, называются автотрофами — продуцентами. Наиболее типичные клетки автотрофов содержат хлорофилл — зеленые пигменты, с помощью которых осуществляется фотосинтез. В процессе фотосинтеза в клетке происходит связывание солнечной энергии и превращение ее в энергию химических связей органических веществ. Солнечная энергия необходима клетке для использования углерода из атмосферной двуокиси углерода и синтеза органического вещества.

Микроорганизмы, принадлежащие ко второму типу,— гетеротрофы (питаемые другими). В отличие от автотрофов им необходим постоянный приток готового органического вещества — белков, углеводов, жиров, которые являются составными частями клеток и тканей. Гетеротрофы получают энергию путем окисления органических веществ в процессе дыхания с участием молекулярного кислорода (аэробный процесс) или при его отсутствии (анаэробный процесс). В конечном счете все живые организмы, в том числе и микроорганизмы, получают энергию от солнца. Автотрофы — непосредственно от солнца, гетеротрофы — опосредованно, косвенным путем, от автотрофов.

Первичные молекулярные механизмы, по которым происходит тот или иной биохимический процесс извлечения энергии, в клетке обеспе- чивают хлоропласты (фотосинтез) и митохондрии (дыхание).

5.2. Переносчики энергии

Специфические молекулы аденозинтрифосфата (АТФ) переносят энергию, полученную в процессах фотосинтеза и дыхания, от центров фотосинтеза и дыхания ко всем участкам клетки, в которых протекают процессы, связанные с потреблением энергии. АТФ впервые был выделен из мышечной ткани в 1930 г. К. Ломаном [18].

В процессе гидролиза АТФ превращается в АДФ (аденозиндифосфат) и неорганический фосфат. В этой реакции свободная энергия моле-

70