Микробиология и основы биотехнологии

Классификация продуктов по их месту в технологической схеме

1.Газы со стадии ферментации (диоксид углерода в спиртовом производстве, биогаз в переработке отходов путем метанового брожения, водород при культивировании фототрофов, очищенный газ, специально пропущенный через биофильтр.

2.Среда ферментации: культуральная жидкость с микроорганизмами (кефир, йогурт) или твердый субстрат (сыр, ферментированный заквасками, колбаса).

3.Концентрат культуральной жидкости — выпаренный или высушенный (лизин и антибиотики).

4.Жидкость, полученная после отделения биомассы от культуральной жидкости. В зависимости от способа разделения она называется: осветленная, надосадочная, нативный раствор, фильтрат, фугат, пермеат, супернатант (ïèâî, âèíî, êâàñ).

5.Концентрат жидкости (см. п. 4), получаемый с помощью выпаривания, сушки, ультрафильтрации.

6.Биомасса инактивированная (кормовые дрожжи, которые на завершающих стадиях подвергаются тепловой стерилизации).

7.Биопрепарат — жизнеспособная биомасса микроорганизмов (пекарские дрожжи, бактериальные средства защиты растений, биопродукты нефтяных загрязнений, бактериальные удобрения, силосные закваски

èт. д.). Биопрепарат может быть изготовлен в жидком или высушенном виде, но входящие в него микроорганизмы должны быть жизнеспособными.

8.Ослабленная биомасса микроорганизмов (живые вакцины).

9.Внеклеточный биопродукт — легкокипящая жидкость (этанол, выделяемый из среды отгонкой или ректификацией).

10.Внеклеточный биопродукт — твердое вещество или высококипящая жидкость, растворенные в культуральной жидкости (медицинские антибиотики, чистые пищевые и медицинские аминокислоты, лимонная кислота).

11.Внутриклеточный продукт (многие антибиотики, витамины, нуклеотиды).

12. Переработанная биомасса микроорганизмов (гидролизаты и ферментолизаты, используемые для кормления животных или как вкусовые добавки; клеточные оболочки, получаемые после разрушения

111

микроорганизмов и применяемые как сорбент для очистки соков, вина, пищевых жидкостей).

13.Очищенный от загрязнений поток жидкости — при очистке сточных вод.

14.Очищенная от загрязнений твердая среда — почва при биоремедиации от нефтепродуктов.

15.Жидкая среда (культуральная жидкость) с экстрагированными (выщелоченными) из твердой фазы компонентами (бактериальное выщелачивание металлов из руд, микробиологическое обессеривание угля

èнефти).

16.Среда ферментации (обычно полутвердая), увеличившая свой объем за счет выделения газов микроорганизмами (сыр, хлеб).

Технологическая схема производства многих из перечисленных видов продуктов может быть укорочена с исключением одной или нескольких стадий в зависимости от целевой задачи, а также свойств микроорганизмов, сырья и готового продукта.

7.5. Основные понятия молекулярной генетики

Для изучения генетики клетки и экспрессии генетической информации на молекулярном уровне необходимо знать состав и строение ДНК, трех разновидностей РНК и белков. Белки, особенно ферменты, непосредственно определяют характер функционирования клетки путем регуляции осуществляющихся в ней биохимических реакций. В известной степени набор клеточных ферментов (типы ферментов и концентрация каждого из них) определяет метаболитические процессы, т. е. природу и особенности осуществляющихся в клетке последовательных и параллельных реакций.

Любая дочерняя клетка должна получать от родительской клетки всю наследственную информацию, необходимую для синтеза тех же самых белков, которые присутствуют в исходной клетке. Механизмы передачи этой информации изучает генетика.

В процессе экспрессии гена нуклеотидная последовательность неповторяющегося информационного биополимера ДНК определяет ход белкового синтеза в клетке. Ãåí — единица наследственной информации клетки, участок ДНК, кодирующий определенный белок. В результате экспрессии гена формируется аминокислотная последовательность со-

112

ответствующего белка. Продуктом является матричная (или информационная) ìÐÍÊ.

На первом этапе экспрессии гена, называемом транскрипцией (правильная передача), сложный олигомерный фермент РНК — полимераза — катализирует синтез ìРНК на матрице, роль которой выполняет ген.

На втором этапе экспрессии гена, называемом трансляцией (перенесение), на основе содержащейся в нуклеотидной последовательности ìРНК информации синтезируется пептидная цепь с соответствующей аминокислотной последовательностью. В процессе трансляции участвуют различные компоненты клетки, в том числе центры и регуляторы пептидного синтеза — рибосомы, а также несколько различных транспортных ÐÍÊ (òРНК), которые переносят химически активированные аминокислоты к месту синтеза пептидной цепи в соответствии с диктуемой ìРНК последовательностью [20].

Подробное изложение перечисленных выше процессов, а также изу- чение генетического кода, являющегося связующим звеном между нуклеотидной и аминокислотной последовательностями, не входит в нашу задачу. Подробно с этими процессами можно ознакомиться в книге Дж. Бейли и Д. Оллис «Основы биохимической инженерии».

7.6. Основные понятия генетической инженерии

Генетическая инженерия — ветвь молекулярной генетики, изу- чающая направленное изменение биологической информации клетки для получения живых существ с запрограммированными фенотипиче- скими признаками.

Фенотипические признаки — совокупность всех свойств и признаков особи на определенной стадии развития, сформировавшимися в результате взаимодействия генотипа с окружающей средой.

Генотип — совокупность всех генов, присущих данной особи. Генетическая инженерия исследует возможности и способы созда-

ния лабораторным путем (in vitro) генетических структур и наследственно измененных организмов, т. е. создает искусственные генетические программы, с помощью которых направленно конструируются молекулярные генетические системы вне организма с последующим их введением в живой организм. При этом сначала ген выделяется из клетки донора, затем выделенный ген присоединяется к ДНК (вектор), способной ввести его в геном реципиента.

113

Геном — совокупность хромосом, содержащих единицы наследственной информации — гены, полный набор генов.

Для данного научного направления употребляют два названия — генетическая инженерия è генная инженерия. Однако их смысловое содержание не одинаково: генетическую инженерию связывают с генетикой, а генная инженерия имеет отношение только к генам.

Генетическая инженерия точнее раскрывает содержание дисциплины — создание генетических программ, основная задача которых заклю- чается в создании in vitro молекул ДНК посредством соединения фрагментов ДНК, которые в естественных условиях чаще не сочетаются из-за межвидовых барьеров (рекомбинантные ДНК). Молекула рекомбинантной ДНК (молекула, полученная вне живой клетки, путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться в клетке) представляет собой соединенные в бесклеточ- ной системе два компонента: вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой («чужеродной») ДНК, содержащий интересующие исследователя генетические элементы.

Генетическая инженерия возникла на стыке многих биологических дисциплин: молекулярной генетики, энзимологии, биохимии нуклеиновых кислот и др. [20].

Биотехнология рекомбинантных ДНК включает как новые методы, так и заимствованные из других дисциплин, в частности из генетики микроорганизмов. К наиболее важным методам биотехнологии рекомбинантных ДНК относят следующие:

1.Специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, что в значительной степени ускоряет выделение различных генов

èманипуляции с ними.

2.Быстрое секвенирование всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющее определить точные границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность полипептида.

3.Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая с большой точ- ностью выявить специфические нуклеотидные последовательности на основе их способности связывать комплементарные основания.

4.Клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК-фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плазмиду или вирус, который используют для трансформации бактерий). Бактериальная клетка после трансформации способна воспроизводить этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий.

114

Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей осуществляется особыми ферментами — рестрикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужеродную ДНК. Такие ферменты условно можно разделить на следующие группы:

1.Используемые для получения фрагментов ДНК.

2.Синтезирующие фрагменты ДНК на матрице РНК.

3.Соединяющие фрагменты ДНК.

4.Изменяющие структуру концов фрагментов ДНК и применяемые для приготовления гибридизационных проб.

Для успешного решения задач генетической инженерии очень важно быстро секвенировать (определить последовательность нуклеотидов) любые очищенные фрагменты ДНК. В настоящее время объем информации о последовательностях ДНК очень велик, поэтому для хранения

èанализа данных о фрагментах и целых геномах необходимо применение новых информационных и компьютерных технологий.

В биотехнологии рекомбинантных ДНК обычно используют два различных метода секвенирования ДНК: химический и ферментативный. Оба метода надежны и позволяют быстро и результативно получить данные.

Результаты секвенирования на основе генетического кода позволяют определить аминокислотную последовательность белка в соответствии с нуклеотидной последовательностью в соответствующем гене. Энзиматический метод секвенирования основан на энзиматическом введении нуклеотида, терменирующего полинуклеотидную цепь. В этом случае обычно используют дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты.

Скорость восстановления (ренатурации) двойной спирали ДНК зависит от вероятности столкновения двух комплементарных нуклеотидных последовательностей и их концентрации в растворе. Скорость реакции гибридизации можно использовать для определения концентрации любых последовательностей РНК или ДНК в смеси, содержащей и другие фрагменты нуклеиновых кислот. Для этого необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный тому фрагменту, который надлежит выявить. Обычно фрагмент ДНК, полученный клонированием либо химическим путем, метят по 32Р в целях прослеживания включения фрагмента в состав дуплексов при гибридизации. Одноцепочечную молекулу ДНК, используемую в данном методе в качестве меченого индикатора, называют ДНК-зондом. Размеры его варьируют от нескольких десят-

115

ков до нескольких сотен и тысяч нуклеотидов. Реакция гибридизации с использованием ДНК-зондов позволяет идентифицировать нуклеотидные последовательности в очень низкой концентрации и тем самым определять, какое количество копий последовательности ДНК, комплементарной ДНК-зонду, присутствует в геноме клетки [20].

ДНК-зонды применяют для поиска родственных генов, а в реакциях гибридизации с РНК — для выявления экспрессии данного гена в различных клетках.

Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма, осуществляют посредством генетической рекомбинации in vitro. Метод был разработан на бактериях, в частности на Е. сoli. Он основан на важном свойстве ДНК — способности к перестройкам, изменяющим комбинацию генов в геноме (полный набор генов) и их экспрессию. Такая уникальная способность ДНК позволяет приспосабливаться данному виду к изменяющейся среде.

Генетическая рекомбинация подразделяется на два больших класса:

общую рекомбинацию и сайт-специфическую рекомбинацию.

Âпроцессе общей рекомбинации генетический обмен в ДНК происходит между гомологичными нуклеотидными последовательностями, например между двумя копиями одной и той же хромосомы в процессе мейоза (кроссинговера), или при скрещивании и перегруппировке генов

óбактерий. Центральная роль в процессе общей генетической рекомбинации отводится комплементарным взаимодействиям нуклеотидных последовательностей. Этот процесс требует участия особого белка гесА, который прочно связывается с одиночными цепями ДНК, одновременно удерживая и двойную спираль.

Âпроцессе сайт-специфической рекомбинации в обмен вступают короткие специфические нуклеотидные последовательности одной и той же или обеих спиралей ДНК, распознаваемые особым сайт-специфиче- ским ферментом, что приводит к трансформации распределения нуклеотидных последовательностей в геноме. Любые комплементарные взаимодействия между двумя гомологичными спиралями ДНК возможны лишь тогда, когда в одной из двух цепей происходит разрыв. К числу факторов, вызывающих одноцепочечные разрывы, относятся: химиче- ские агенты, некоторые виды излучения, специфические белки.

Генетическая инженерия позволяет получать модифицированные версии генов и затем внедрять их в клетки.

116

Технология рекомбинантных ДНК оказала существенное воздействие на всю клеточную биологию и позволила изучить деление, строение и функции не только белков, но и индивидуальных доменов (надцарств), а также расшифровать механизмы регуляции экспрессии генов, полу- чить многие белки, участвующие в регуляции обменных процессов, клеточной информации и развитии организма.

Практическое использование генетической инженерии

Применение методов генетической инженерии в животноводстве открывает перспективу изменения ряда свойств организма: повышение продуктивности и резистентности к заболеваниям, увеличение скорости роста, улучшение качества продукции и др. Животных, несущих в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принято называть трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципиента,— трансгеном. Продукт этого гена — белок — является трансгенным. Благодаря переносу генов у трансгенных животных возникают новые качества, а дальнейшая селекция позволяет закрепить их в потомстве и создать трансгенные линии.

Получение трансгенных животных предусматривает ряд этапов, включающих: приготовление раствора ДНК для микроинъекции; извле- чение эмбрионов из донорных организмов; микроинъекция ДНК и пересадка инъецированных эмбрионов в яйцеводы или после культивирования в матку синхронизированных реципиентов.

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. Инсулин — это гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. По своей биохимической природе инсулин представляет собой небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Недостаток этого гормона приводит к одному из тяжелейших заболеваний — сахарному диабету. В 1980 г. датская компания «Ново-индастри» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека путем замещения 30-го остатка аланина в цепи В на остаток треонина. Оба инсулина не различа- лись по активности и времени действия.

В настоящее время методами генетической инженерии синтезированы: соматостатин (гормон гипоталамуса), который подавляет выделение инсулина и гормона роста человека, и соматотропин (гормон роста

117

человека (ГРЧ)), которые секретируются передней долей гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию гипофизарной карликовостью [20].

Фактор устойчивости клеток к вирусной инфекции, препятствующий (интерферирующий) размножению вирусов в клетке, был назван интерфероном. Интерфероны широко используются для лечения различных тяжелых заболеваний (острого вирусного гепатита, рассеянного склероза, остеосаркомы, миеломы и др.). Синтезированный генно-инже- нерным способом интерферон был выделен, очищен, и его физико-хими- ческие свойства оказались близкими по свойствам к интерферону, полу- ченному из крови доноров. При использовании генно-инженерных технологий были получены штаммы бактерий, продуцирующие различные интерфероны: -, -, -типов. Несмотря на успехи, достигнутые в области получения интерферонов с помощью генно-инженерных технологий и их применения для лечения различных вирусных заболеваний, в том числе онкологических, многие задачи остались нерешенными.

В растениеводстве генно-инженерные методы, в частности технологии рекомбинантных ДНК, позволяют создать новые генотипы и, следовательно, новые формы растений гораздо быстрее, чем классические методы селекции. Появляется возможность целенаправленного изменения генотипа — трансформации — благодаря введению определенных генов. Этими методами можно получить растения, устойчивые к стрессовым факторам, фитопатогенам, гербицидам и пестицидам; усилить скороспелость плодов; повысить эффективность процесса фотосинтеза; улучшить аминокислотный состав запасных белков; расширить круг культурных растений, способных к симбиотической способности фиксации азота и т. д.

7.7. Иммобилизованные ферменты

Принципиально новые перспективы открылись перед прикладной энзимологией в результате появления в 60-е гг. ХХ в. на стыке химии и биологии новой отрасли — инженерной энзимологии. Ее задачи заключаются в использовании прогрессивных методов выделения ферментов, их стабилизации и иммобилизации; конструировании катализаторов с нужными свойствами и разработке научных основ их применения [19, 20].

Методами белковой инженерии, позволяющей изменять первичную структуру природной молекулы фермента посредством химической моди-

118

фикации самого энзима или его гена, удается принципиально трансформировать структуру активного центра и его функцию, моделировать субстратную специфичность и физико-химические свойства фермента. Многие проблемы технологии синтеза органических соединений, пищевой

èмедицинской промышленностей, мониторинга человека и окружающей среды, защиты окружающей среды, энергетики не могут быть решены без использования методов современной инженерной энзимологии.

Важным этапом развития инженерной энзимологии является разработка способов получения иммобилизованных ферментов.

Иммобилизованные ферменты — это ферменты, искусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраняющие свои каталитиче- ские свойства.

Термин «иммобилизованные ферменты» был узаконен на первой конференции по инженерной энзимологии в 1971 г. Однако в понятие «иммобилизация» в настоящее время вкладывают более широкий смысл, а именно — полное или частичное ограничение свободы движения белковых молекул [19].

Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ по сравнению со свободными молекулами. Такие ферменты, представляя собой гетерогенные катализаторы, которые легко отделяются от реакционной среды, могут использоваться многократно и обеспечивают непрерывность каталитического процесса. Процесс иммобилизации ведет к изменению свойств фермента: субстратной специфичности, устойчивости, зависимости активности от параметров среды. Иммобилизованные ферменты долговечны и в тысячи и десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов.

Идеальные материалы, используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими свойствами: нерастворимостью; высокой химической и биологической стойкостью; значительной гидрофильностью; достаточной проницаемостью, как для ферментов, так

èдля коферментов, субстратов и продуктов реакции; способностью носителя не препятствовать активации фермента.

Âнастоящее время не существует универсального носителя, который полностью соответствовал бы перечисленным требованиям, но существует широкий набор носителей, пригодных для иммобилизации определенных энзимов в конкретных условиях.

Âзависимости от химической природы носители делятся на органи- ческие и неорганические.

119

Органические полимерные носители можно разделить на два класса: природные и синтетические. В зависимости от их строения органические носители подразделяются на группы. Среди природных полимеров выделяют белковые, полисахаридные и липидные носители, среди синтетиче- ских — полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные. К преимуществам природных носителей относятся их доступность, полифункциональность и гидрофильность, к недостаткам — биодеградируемость и достаточно высокая стоимость. К полисахаридным полимерам, часто используемым для иммобилизации, относятся: целлюлоза, декстрин, агароза и их производные. Из природных аминосахаридов в качестве носителей для иммобилизации применяют хитин (отход промышленной переработки крабов и креветок). Он химически стоек и имеет хорошо выраженную пористую структуру. Среди белков в качестве носителей применяют структурные протеины: кератин, фиброин, коллаген и продукт переработки коллагена — желатину. Эти белки широко распространены в природе, поэтому доступны в значительных количествах, дешевы и имеют большое число функциональных групп для связывания фермента. Белки способны к биодеградации, это свойство важно при конструировании иммобилизованных ферментов для медицинских целей. К недостаткам белков как носителей в этом случае следует отнести их высокую иммуногенность.

Синтетические полимерные носители. Материалы этой группы широко используются как носители для иммобилизации благодаря разнообразию и доступности. К ним относятся полимеры на основе стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта, полиамидные и полиуретановые полимеры. Полимерные носители обладают механической прочностью, обеспечивают возможность варьирования в широких пределах величины пор, введения различных функциональных групп. Некоторые синтетические полимеры могут приобретать различную физиче- скую форму при их обработке (трубы, волокна, гранулы). Все эти свойства полезны для различных способов иммобилизации ферментов.

Ê носителям неорганической природы относятся материалы, изготовленные из стекла, глины, керамики, графитовой сажи, силикагеля, а также оксиды металлов. Их можно подвергать химической модификации, с этой целью их покрывают пленкой из оксидов алюминия, титана, гафния, циркония или обрабатывают органическими полимерами. Основное преимущество неорганических носителей — простота регенерации, возможность получения любой формы и степени пористости.

120