Микробиология и основы биотехнологии

лый газ, водород, метан). В щелочной фазе анаэробной деструкции органического вещества выделяется большое количество метана, поэтому ее называют метаногенной [24].

Механизм образования метана не имеет единой схемы. Процесс зависит от вида организма и вещества, на которое он действует. Анаэробный ил и биопленка развиваются в экосистемах с доминированием аноксигенных и анаэробных условий, в которых протекают процессы брожения, аноксигенного окисления и метанообразования. Такие условия наблюдаются в метантенках, септиках, анаэробных биофильтрах при очистке сточных вод и сбраживании органических отходов [21].

Âмикробиотопах аэробного активного ила или биопленки аэробные микроорганизмы находятся снаружи гранулы или пленки. Во внутренней зоне флокул ила и пленок возможно развитие процессов брожения сахаров, аминокислот, маслянокислое брожение и др., но отсутствуют условия для развития метаногенных бактерий.

Âактивном иле, где диффузия кислорода затруднена, аэробное дыхание сменяется на анаэробное от поверхности вглубь гранулы или биопленки.

Âгранулах и флокулах метаногенного ила и в пленках сооружений анаэробной очистки снаружи развиваются сульфатредукторы, а внутри — метаногены. В промежуточном слое присутствуют ацидогенные

èгетероацетогенные бактерии, которые сбраживают субстраты до низкомолекулярных органических кислот и обеспечивают сульфатредукторов и метаногенов водородом и ацетатом [39].

По видовому составу анаэробный ил и биопленка менее разнообразны по сравнению с аэробными. В активном иле метантенков встречается около 50 видов бактерий, осуществляющих различные стадии брожения

èметанообразования: протеолиз белков и аммонификацию, гидролиз целлюлозы, сбраживание промежуточных продуктов гидролиза, углеводов, аминокислот до органических кислот: уксусной, пропионовой, масляной (ацидогенные бактерии), конверсию пропионата и бутирата до ацетата

èводорода (гетероацетогенные бактерии), метаногенерацию (метаногенные бактерии). Встречаются сульфатредукторы. Количество анаэробных бактерий достигает 15 млрд/мл ила. В метантенк вместе со сбраживаемым материалом могут попадать грибы, дрожжи и простейшие организмы.

Микрофлора активного ила и биопленок анаэробных реакторов формируется в результате жизнедеятельности микроорганизмов, попавших

181

вместе со сточными водами, а также аборигенной микрофлоры (при анаэробных процессах очистки). На формирование анаэробного ила и биопленки требуется значительно больше времени, чем на формирование аэробных [39].

Для анаэробного сбраживания концентрированных сточных вод (ХПК — 30–40 г/дм3) используют двухступенчатые метантенки. Одноступенчатые метантенки используются для обработки осадка из сточной жидкости и избыточного активного ила. Твердая фаза (осадок) смеси промышленных и хозяйственно-бытовых сточных вод содержит 95–96 % воды; оставшиеся 4–5 % представлены углеводородами, жироподобными и целлюлозоподобными веществами, белками.

В результате переработки осадка в метантенках изменяется физиче- ская структура и он переходит в рассыпчатое, удобное для утилизации вещество; уменьшается масса из-за выделения газов и обеззараживания осадка.

Метантенк. Сооружение представляет собой бродильную камеру с коническим днищем, герметичным перекрытием и колпаком для сбора газа. Аппаратурное оформление, форма, размеры метантенков разнообразны. Основными параметрами анаэробного сбраживания являются: температура, регулирующая интенсивность процесса, доза загрузки осадка и тщательность перемешивания септического ила со свежей загрузкой.

Величину распада органического вещества в метантенках рассчитывают по выходу газа и химическому составу сброженного осадка. Выход газа при сбраживании осадка обусловлен распадом углеводов, жироподобных веществ и белков, составляющих основную массу беззольного вещества осадка.

Полного сбраживания органических веществ осадка и его компонентов, независимо от условий сбраживания, в метантенках достичь невозможно. Все вещества имеют свой предел сбраживания, зависящий от химической природы. В среднем степень распада органических веществ составляет 70 %. В процессе сбраживания выделяются газы: метан — 63–65 %, углекислый газ — 32–34 %.

Процессы брожения в метантенках осуществляются в мезофильных (30–35 °С) и термофильных (50–55 °С) условиях, что оказывает большое влияние на состав и численность микрофлоры.

Механизм метанового брожения. Механизм образования метана не имеет единой схемы, процесс зависит от вида организма и от вещества,

182

на которое он действует. Метаногенные бактерии (Mb. formicum) способны превращать СО в СН4 как в присутствии водорода, так и в его отсутствии:

4Í2 + ÑÎ2 = ÑÍ4 + 2Í2Î.

На среде, содержащей этиловый спирт, Mb. omelianskii образует метан путем восстановления диоксида углерода, а этиловый спирт окисляется в уксусную кислоту:

2C2Í5ÎÍ + ÑÎ2 = ÑÍ4 + 2ÑÍ3ÑÎÎÍ.

Культура Methanosarcina barkerii из метильной группы уксусной кислоты выделяет метан по уравнению

ÑÍ3ÑÎÎÍ = ÑÍ4 + ÑÎ2.

Большую часть метана на среде, содержащей метиловый спирт, Methanosarcina methanica образует из диоксида углерода при этом происходит восстановление метилового спирта до метана:

4ÑÍ3ÎÍ = 3ÑÍ4 + ÑÎ2 + 2Í2Î.

Сложность изучения различных видов метаногенных микроорганизмов связана с тем, что они являются строгими анаэробами, их трудно изолировать и они медленно развиваются в культурах. Медленное развитие метаногенных бактерий в питательной среде связано с ее окислитель- но-восстановительными условиями. Установлена прямая зависимость механизма преобразования органического вещества от rН2 (степени аэробности) среды [40].

Вопросы для самоконтроля

1.В чем заключается сущность биологической очистки?

2.Какие условия необходимы для протекания нормального процесса аэробной биохимической очистки?

3.Перечислите основные сооружения аэробной биохимической очистки? В чем заключается цель использования каждого из них?

4.Что представляет собой экосистема активного ила? Какова его роль?

183

Глава 10 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

ÂТЕХНОЛОГИЯХ БИОРЕМЕДИАЦИИ ПОЧВ

ÈБИОХИМИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ ПЫЛЕГАЗОВЫХ

ВЫБРОСОВ

10.1.Биоремедиация почв от загрязнения нефтью

èнефтепродуктами

Предупреждение и ликвидация нефтяных загрязнений почв и грунтов, а также отходов, содержащих нефтепродукты, является актуальной проблемой промышленных предприятий.

При попадании нефти и нефтепродуктов происходят глубокие и необратимые изменения физических, морфологических, физико-химиче- ских и биологических свойств почв. Нефтяные углеводороды через трофические цепи могут оказать канцерогенное воздействие на организм че- ловека. Одним из эффективных способов очистки почвы от нефтяных загрязнений является биоремедиация — процесс возвращения почвы к естественному состоянию посредством использования комплекса механических, физико-химических и биологических методов.

Источники поступления нефтяного загрязнения в экосистему поч- вы. Загрязнение экосистемы почвы нефтью или нефтепродуктами может происходить на этапах добычи, транспортировки, переработки и использования различных нефтепродуктов. Загрязнение объектов окружающей среды происходит в результате аварийного разлива сырой нефти, нефтепродуктов и буровых растворов; размещения твердых и жидких отходов: нефтегрунтов, асфальто-смоло-парафинистых отходов (АСПО), смеси воды, нефтепродуктов тяжелой фракции и механических примесей, образующихся при ремонте скважин, зачистке резервуаров хранения нефти, нефтезагрязненного снега.

Общая характеристика элементарного и фракционного состава нефти, ее физические и химические свойства. Нефть представляет собой

185

сложную природную смесь углеводородов различных классов, а также гетерогенных органических соединений (сернистых, азотистых, кислородных и др.).

Главными элементами ее являются: С — 83–87 %, Н — 12–14 %, О — 1–2 %, S — 3–6 %. Десятые и сотые доли процента составляют многочисленные микроэлементы. Групповой состав нефти определяют в основном три класса углеводородов: метановые или парафиновые (алканы); полиметиленовые или нафтеновые (циклоалканы); ароматические.

В качестве эколого-геохимических характеристик основного состава нефти принято содержание легкой фракции (начало кипения 200 °С), включающей: низкомолекулярные метановые (алканы), нафтеновые (циклопарафиновые) и ароматические углеводороды — наиболее подвижная часть нефти, высокомолекулярные метановые углеводороды (включая твердые парафины). К циклическим углеводородам относятся нафтеновые (циклоалканы) и ароматические углеводороды (арены). Смолы и асфальтены являются высокомолекулярными неуглеводородными продуктами и играют исключительную роль в составе нефти, определяя во многом ее физические свойства и химическую активность. Смолы — вязкие мазеподобные вещества, асфальтены — твердые соединения, не растворимые в низкомолекулярных углеводородах. Из сернистых соединений в нефти наиболее часто обнаруживаются сероводород, меркаптаны, сульфиды, дисульфиды, тиофены, свободная сера. Сернистые соединения токсичны для живых организмов [41, 42].

Физические свойства нефти, в том числе органолептические, зависят от месторождения. По цвету нефть может быть бесцветной, черной, коричневой, янтарной, зеленой. Характер запаха — скипидара, камфары, эфира.

К основным физическим свойствам относятся плотность, вязкость,

теплота сгорания, испаряемость, температура кипения.

Ïî плотности нефти условно делят на: легкие с плотностью 820–860, средние — 860–900, тяжелые — 900–950 кг/м3. Плотность пластовой нефти зависит от ее состава, давления, температуры, количества растворенного газа. Вязкость нефти уменьшается с повышением в ней растворенного углеводородного газа и температуры и увеличивается с повышением давления [43].

Теплота сгорания характеризует количество тепла, выделившегося при сгорании 1 кг жидкости. Различают высшую теплоту сгорания

186

(QÂ) — количество тепла, выделившегося при сгорании 1 кг жидкости при наличии в ней влаги, и низшую теплоту сгорания (QÍ), которая определяется количеством тепла, выделившегося при сгорании 1 кг жидкости за вычетом тепла, израсходованного на испарение воды и влаги. Теплота сгорания возрастает с увеличением вязкости, молекулярных масс газообразного углерода и фракций [42].

Испаряемость нефти и нефтепродуктов — способность переходить из жидкой фазы (масляной фракции) в паровую. Скорость испарения зависит от состава, площади испарения, скорости движения воздуха, давления насыщенных паров нефти и нефтепродуктов, типа емкости, в которой они находятся.

Температура кипения зависит от состава нефти. Легкие фракции содержат больше бензина, керосина, а тяжелые — газойля и мазута. Чем выше граница кипения фракции, тем она тяжелее [44].

Определить индивидуальный химический состав нефти полностью практически невозможно, поэтому ограничиваются определением хими- ческого состава отдельных групп углеводородов: алканов, циклоалканов, ароматических углеводородов, непредельных углеводородов, неуглеводородных соединений [45]. В настоящее время в нефти обнаружены 425 индивидуальных углеводородов, содержащих серу, азот, кислород [46, 47].

Оценка метода биоремедиации. В результате длительности процессов естественной деструкции нефтяных загрязнений в почвах (в среднем более 4–5 лет) большое значение приобретают в последние годы искусственные методы, ускоряющие данный процесс. Среди различных методов, применяемых с этой целью, наиболее экологически безопасным, эффективным и перспективным является метод биоремедиации, основанный на биохимических окислительных процессах углеводородов под действием микроорганизмов.

В настоящее время существуют два основных подхода к очистке загрязнения почв и грунтов: обработка на месте (in situ) или экскавация, т. е. вывоз и обработка на специальных предприятиях (eх situ) [48].

Микробиологическая трансформация нефти и нефтепродуктов в поч- ве базируется на следующих подходах:

• известкование, внесение минеральных и органических удобрений, рыхление, внесение сорбента, улучшение водно-воздушного и питательного режима почвы;

187

•активация автохтонной (собственной) микрофлоры с целью увеличения численности нефтеокисляющих микроорганизмов;

•интродукция адаптированных к нефтезагрязнениям и условиям среды штаммов микроорганизмов — деструкторов нефти и нефтепродуктов;

•посев специфических растений — сидератов, толерантных к нефти и нефтепродуктам [49].

Биоремедиация может быть реализована в результате проведения следующих мероприятий [50]:

• биостимуляции природного микробиоценоза путем внесения в среду биогенов (азота и фосфора) и минеральных солей, содержащих катионы натрия, кальция, магния, двухвалентного железа;

•улучшения природного биоценоза путем внесения относительно большого количества микроорганизмов — деструкторов, ранее выделенных микробиологическими способами из загрязненного биоценоза и размноженных в виде биопрепарата;

•обработки очищаемого участка полученным биопрепаратом. Биоремедиация завершается процессом фиторемедиации — посе-

вом однолетних бобовых культур, в результате чего происходит трансформация низких остаточных концентраций токсичных углеводородов в безвредные вещества.

Восстановление растительного покрова в конце первого вегетационного сезона проводят путем посева однолетних устойчивых трав с последующей их сидерацией во втором сезоне (используются преимущественно злаковые и бобовые культуры). Устойчивый травяной покров на очи- щенном почвогрунте свидетельствует о положительных результатах.

Факторы, обеспечивающие эффективность процесса биоремедиации

Одним из основных факторов, лимитирующим процесс микробиологической деструкции, является газовоздушный режим нефтезагрязненной почвы. Доступность кислорода для аэробной микрофлоры — важное условие для утилизации нефтяного загрязнения [51, 52]. Рыхление почвы увеличивает диффузию кислорода, снижает концентрацию углеводородов в результате улетучивания легких фракций, обеспечивает разрыв поверхностных пор, насыщенных нефтью, способствуя равномерному распределению компонентов нефти и нефтепродуктов в почве

188

и увеличению активной поверхности. В результате механической обработки почвы создается биологически активный слой с улучшенными агрофизическими свойствами, оптимальным водным, газовоздушным и тепловым режимом, что обеспечивает рост численности микроорганизмов, их высокую ферментативную активность.

Температура определяет интенсивность микробиальной деструкции нефти и нефтепродуктов. Оптимальной температурой этого процесса является температура 20–37 °С. Одним из эффективных приемов регулирования температуры почвы в зонах с умеренным и холодным климатом является покрытие загрязненных участков темной полиэтиленовой пленкой [53].

Влажность оказывает эффективное воздействие на темпы деструкции нефти и нефтепродуктов в почве. Благоприятный водный режим достигается путем полива. Влажность почвы должна поддерживаться на уровне не ниже 30–40 %. Водный режим улучшает агрохимические свойства почвы, влияет на подвижность питательных веществ, микробиологическую деятельность и активность биохимических процессов.

Реакция среды (рН). Оптимальной средой для роста большинства микроорганизмов на углеводородах являются значения рН, близкие к нейтральным: 6,5–8,5. Кислые почвы подвергают известкованию.

Для нормальной жизнедеятельности микроорганизмов необходимы биогенные элементы: углерод, азот, водород, кислород и различные зольные элементы: фосфор, калий, кальций, магний, железо, сера. Оптимальная среда для роста и развития нефтеокисляющих микроорганизмов имеет следующий состав: КН2ÐÎ4 — 0,65 ã/äì3; Nà2ÍÐÎ4 — 1,3 ã/äì3; ÌgSO4 — 0,07 ã/äì3; CaCI2, FeSO4, ZnSO4 — следы [52].

Органический материал. Внесение органических добавок в почву (навоз, птичий помет, торф, древесные опилки) способствует ускорению процесса деструкции, улучшает ее структуру, оптимизирует физиче- ские, химические и биологические свойства.

Микроорганизмы, участвующие в трансформации нефтяных загрязнений

Микроорганизмы, разлагающие нефть, являются обычными представителями биоценоза почв, способные окислять жидкие парафины и значительно реже — летучие углеводороды. В почвах, загрязненных нефтью, преобладают микроорганизмы, способные использовать в каче-

189

стве источников питания í-алканы и ароматические углеводороды. Каждый микроорганизм в процессе деструкции и усвоения нефтяных загрязнений выполняет строго определенную роль по отношению к различным видам нефти и нефтепродуктам, и в зависимости от состава клетки микроорганизмы делятся на липофильные, концентрирующиеся в углеводородной фазе, и гидрофильные, концентрирующиеся в водной фазе. Липофильные микроорганизмы развиваются непосредственно в нефтяной пленке, что существенно ускоряет процесс очистки от нефтяного загрязнения. Гидрофильные микроорганизмы способны к утилизации только растворенных в воде соединений.

При использовании гидрофильной культуры микроорганизмов процесс очистки от нефтяного загрязнения идет только в зоне контакта углеводорода с водой из-за низкой растворимости нефти в воде. Скорость процесса лимитируется скоростью диффузии компонента загрязнителя и площадью контакта.

Механизм деструкции нефти и нефтепродуктов легче всего проследить на отдельных представителях и группах углеводородов, содержащихся в нефти [54].

Кроме липофильных и гидрофильных микроорганизмов деструкцию осуществляют и другие виды.

Метан, метанол, метилированные амины, формальдегид и другие углеродсодержащие соединения способны окисляться метилотрофными микроорганизмами.

Микроорганизмы родов Mócobacterium, Flavobacterium, Nocardia

способны окислять этан, пропан, бутан. В большинстве случаев микрофлора окисляет углеводороды до конечных продуктов: двуокиси углерода и воды. Процесс деструкции осуществляется в аэробных условиях.

Для нефтезагрязненных почв характерно присутствие узкоспециализированных видов микроорганизмов, окисляющих газообразные углеводороды, например термофильные спорообразующие бактерии (Bacillus subtilis, Bacillus brevis), усваивающие твердые парафины. Бактерии родов Rhodococcus, Aguaspirillum, Pseudomonas способны разрушать до 20–40 % ароматической фракции нефти. При концентрации нефти от 50 до 200 мл/кг появляются виды микроскопических грибов Aspergillus ustus è Penicillium tardum [55].

Биодеструкция сероорганических соединений происходит под действием бактерии Thiobacterium species и гриба Fusarium species.

190