Микробиология и основы биотехнологии

наруженные в дождевой воде, настое мяса и других объектах. Этот период истории микробиологии можно условно назвать описательным.

Физиологический этап развития микробиологии, когда в основу исследований был положен экспериментальный метод, начался с середины XIX в. и связан с именами французского химика Луи Пастера и немецкого сельского врача Роберта Коха.

Л. Пастер установил, что микроорганизмы различаются между собой не только внешним видом, но и характером своей жизнедеятельности, вызывая химические превращения субстратов, и опроверг теорию самозарождения. Исследуя природу брожений, он показал, что каждое брожение имеет главный конечный продукт и вызывается микроорганизмами определенного типа. Это исследование послужило открытию анаэробного метаболизма и показало, что анаэробный метаболизм энергетически менее выгоден, чем аэробный. Л. Пастер установил причину порчи вина и пива и предложил способ их тепловой обработки, получивший название «пастеризация», который широко используется в настоящее время для обработки молока, соков и напитков. Он открыл природу заразных болезней человека и животных и установил, что причиной инфекции (заражения) являются особые микроорганизмы. Пастер разработал и научно обосновал метод предупреждения заразных болезней с помощью предохраняющих прививок и впервые изготовил вакцины (лат. Vacca — корова) против бешенства и сибирской язвы.

Исследования микробной природы многих заболеваний человека в дальнейшем велись институтами Л. Пастера в Париже и Р. Коха в Берне. С целью доказательства микробной этиологии заболевания Р. Кох сформулировал триаду:

1.Микроорганизм должен присутствовать в материале больного.

2.Выделенный в чистой культуре, микроорганизм способен вызывать эту же болезнь.

3.Возбудитель заболевания при экспериментально вызванном повторном заболевании должен снова быть выделен в чистую культуру,

èобе чистые культуры должны быть идентичными.

Ð.Кох ввел в практику эксперимента методы получения чистых культур, используя в микробиологических исследованиях твердые среды на основе желатины и агара.

Выяснение роли микроорганизмов в биотических круговоротах элементов связано с именами С. Н. Виноградского и М. Бейеринка.

11

С. Н. Виноградскому принадлежит открытие хемолитотрофии, он изучал серные и нитрифицирующие бактерии и разработал метод накопительных культур.

Независимо друг от друга С. Н. Виноградский и М. Бейеринк показали, что фиксацию молекулярного азота способны производить только микроорганизмы. Они выделили свободноживущих симбиотических азотфиксаторов.

В XX в. Д. И. Ивановский открыл особую группу организмов, не имеющих клеточного строения,— вирус табачной мозаики.

Развитие отечественной микробиологии в XX в. связано с деятельностью многих ученых с мировым именем. Большой вклад в геносистематику микроорганизмов внесли А. Н. Белозерский и А. С. Спирин.

Клеточные структуры микроорганизмов и их функции были подробно изучены М. Н. Мейселем с коллегами. В. Н. Шапошниковым была создана теория физиологической двухфазности брожений, что позволило управлять процессами получения важных продуктов в микробиологиче- ском производстве. Экологическое направление работ В. Л. Омелянского представлено разработками схем круговорота веществ в природе и изуче- нием жизнедеятельности микроорганизмов, участвующих в глобальных циклах азота (нитрификаторов и азотфиксаторов), серы (гнилостных, сульфатредуцирующих и тионовых бактерий), железа (железобактерий).

Микробные сообщества и их роль в различных природных и искусственных местообитаниях изучались М. В. Ивановым и Г. А. Заварзиным. Теория роста и развития микроорганизмов, позволяющая управлять процессами их культивирования, была разработана Н. Д. Иерусалимским. Основы управляемого культивирования грибов и водорослей разработаны Е. Е. Успенским и С. И. Кузнецовым. Получение витамина В12 с помощью метаногенных микроорганизмов было предложено В. Н. Букиным и В. Я. Быховским.

Развитие таких наук, как генетика, вирусология, микробиология, растениеводство, явилось толчком для практического использования результатов исследований в биотехнологических процессах.

Популяризация науки биотехнологии в 80-е годы двадцатого столетия принадлежит биологу Альберту Сассону, который описал уникальные возможности практического использования микроорганизмов.

Основы проектирования, разработки и применения процессов, связанных с переработкой биологических материалов и использованием

12

биологических агентов (ферментов и клеток), предложены американскими специалистами Дж. Бейли и Д. Оллис в двухтомнике «Основы биохимической инженерии» [2,3]. Написанный ими фундаментальный труд является попыткой заполнить пробел, существующий между биологией и технологией на их пути к биотехнологии.

1.3. Место микроорганизмов в природе. Три царства живой природы и их отличительные особенности

Основой классификации живых существ служат различия во внешнем виде и строении. Эти различия вытекают из принципиальной разницы в способе питания.

Животные — гетеротрофы, они питаются готовым органическим веществом и поэтому нуждаются в пищевом тракте (измельчение, переваривание, всасывание). Развитие животного организма должно обеспе- чиваться созданием внутренних всасывающих поверхностей. Такой принцип строения существует во всем животном царстве от кишечнополостных (гидра) до высших позвоночных. Растения — автотрофы, они имеют другой тип питания — фотосинтез. Клетки и ткани растений ориентированы наружу и образуют обширные внешние поверхности. Кроме того, животные от растений отличаются строением клеточных стенок, способностью к активному движению и синтезу определенных веществ.

Миры животных и растений различались довольно четко до тех пор, пока ничего не было известно о микроорганизмах. В 1866 г. Э. Геккель для третьего царства живых существ предложил собирательное название — протисты (ãðå÷. protistos — самый первый). Термин «микроорганизм» указывает только на их малую величину, смыслу же соответствует название «протисты». К протистам относятся организмы морфологически слабо дифференцированные, большинство из них одноклеточные. На основании особенностей строения клеток их разделили на две группы:

1.Высшие протисты — организмы, сходные с животными и растительными клетками, являющиеся эукариотами (греч. karóon — ÿäðî).

Êэтой группе отнесены водоросли, грибы, простейшие.

2.Низшие протисты, отличающиеся от других организмов по строению своих клеток,— прокариоты (доядерные). В эту группу включают бактерий, сине-зеленые водоросли, риккетсий, известных как облигатные внутриклеточные паразиты [4].

13

Вирусы (греч. virus — яд), как неклеточные частицы, противопоставляются остальным организмам. Они не способны размножаться самостоятельно, их жизнедеятельность может протекать только внутри живых клеток хозяина.

1.4. Общие свойства микроорганизмов

Отличительный признак микроорганизмов, отраженный в самом их названии,— крайне малые размеры отдельной особи. Малые размеры дали не только основание для отделения микроорганизмов от животных и растений, но ими определяются морфология, «гибкость» обмена веществ микроорганизмов, их экология, отсутствие необходимости сохранения ферментов «про запас».

Диаметр большинства бактерий не превышает 0,001 мм. Поэтому в микробиологии используют единицу измерения — микрометр (1 мкм = 10–3 мм). Поверхность клетки у микроорганизмов намного больше объема, благодаря этому осуществляется весьма активный обмен клетки со средой.

По своему химическому составу все живые организмы, в том числе и микроорганизмы, во многом сходны: важнейшими компонентами их клеток являются ДНК, РНК и белок. Основная структурная единица — клетка (греч. êótos) — универсальна. Электронноскопия клеток позволила установить существенные различия между бактериями и сине-зелеными водорослями, с одной стороны, и животными и растениями, с другой стороны.

Представителей первой группы стали называть прокариоты (ануклеобионты — безъядерные), второй — эукариоты (нуклеобионты — имеющие ядро). Прокариоты рассматриваются как реликтовые формы, у которых деление клетки на отдельные пространственно-разграниченные части — «отсеки» — выражено слабо; ДНК лежит свободно, погруженная в нуклеоплазму; митохондрии и хлоропласты отсутствуют; органы движения устроены просто; клеточная стенка состоит из гетерополимерного вещества, которого нет у эукариотов. Морфологически прокариоты мало дифференцированы: они представляют собой прямые или изогнутые палочки. Простота их строения контрастирует с чрезвычайным разнообразием и пластичностью метаболитических процессов. Прокариоты способны жить в анаэробных условиях, среди них встречаются организмы, способные использовать энергию света или извлекать ее из органических и неорганических соединений либо из двуокиси углерода.

14

Эукариоты имеют ядро, в котором существует определенный набор хромосом. В процессе деления набор их передается двум дочерним клеткам. В цитоплазме эукариотов содержатся митохондрии и пластиды, цитоплазматическая мембрана переходит внутри клетки в эндоплазматиче- скую сеть и ядерную мембрану.

Благодаря большому физиологическому разнообразию, гибкости, высокой скорости обменных процессов, быстрому росту, простому строению клетки и несложной структуре генетического аппарата прокариоты широко расселились во всех областях биосферы (почва, вода, воздух).

1.5. Классификации микроорганизмов. Современные представления о классификации

Классификация, или таксономия (греч. taxis — расположение в порядке и nomos — закон), заключается в расположении организмов по их отдельным группам (категориям), каждая из которых имеет свое название: класс, порядок, семейство, род, вид.

Различают естественную и искусственную классификацию. Систематика микроорганизмов сложна, и до настоящего времени отсутствует единая естественная филогенетическаÿ (ãðå÷. phile — племя, род, вид и genesis — происхождение, образование) классификация, отражающая эволюционный процесс развития всех органических форм в течение всего времени существования жизни на Земле. В соответствии с искусственной систематикой положение многих видов микроорганизмов точно не установлено. В настоящее время для названия любого вида микроорганизмов существует бинарная (лат. binarus — двойной, из двух частей) номенклатура, например: Bacterium denitrificans, Clostridium pasterianum, Beggiatoa mirabilis.

В классификации микроорганизмов используется и более узкое понятие, чем вид,— это штамм, т. е. чистая культура одного и того же вида, выделенная из различных мест обитания.

Искусственная систематика служит для идентификации (лат. identificare — отождествление, распознавание) микроорганизмов, имеющихся в руководствах и определителях. С целью идентификации микроорганизмов изучают следующие признаки:

1) морфологические — форму, размеры, способы размножения, наличие и положение жгутиков, спорообразование, окраску по Граму;

15

2)культуральные — характер роста культуры микроорганизмов на различных твердых и жидких питательных средах (тип колоний, края, цвет, размер, осадок, пленка и т. д.);

3)физиологические — отношение микроорганизмов к различным источникам питания (углероду, азоту, аминокислотам) и характер продуктов обмена — метаболитов;

4)биохимические — потребность микрофлоры в кислороде, способы получения энергии, патогенность (греч. pathos — боль, страдание), источники питания;

5)серологические — отношение микрофлоры к реакциям с иммунными (лат. immunis — свободный от чего-либо, невосприимчивый к болезням, ядам) сыворотками и состав ДНК.

По морфологическим признакам все микроорганизмы классифицируются по группам: вирусы, риккетсии, бактерии, проактиномицеты, актиномицеты, микроскопические грибы, микроскопические водоросли, простейшие, коловратки, черви, насекомые, ракообразные.

Вирусы (Virus)

Вирусы открыты русским ученым Д. И. Ивановским в 1892 г. Они представляют особую группу организмов более простого строения, чем бактерии, размеры их варьируются от десятых до сотых долей микрона, поэтому они проходят через мелкопористые бактериологические фильтры и называются фильтрующимися. Вирусы видимы только с помощью электронного микроскопа. Лишь наиболее крупные вирусы после специальной обработки могут быть видимы и в световом микроскопе [5].

Вирусы неоднородны по химическому составу. Одни из них состоят только из белка и нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), другие содержат еще липиды и полисахариды.

Отличительные признаки вирусов:

•внутри них находится нуклеиновая кислота в виде спирали;

•не растут вне клетки хозяина;

•не имеют клеточной структуры (ядра, цитоплазмы, оболочки);

•не размножаются делением.

Строение вируса. Вирусная частица — вирион — состоит из генети- ческого материала (РНК или ДНК). Периферический слой частицы окружен белковой «оболочкой» (капсидом). У некоторых вирусов, например у вируса табачной мозаики (ВТМ), вируса бородавки, аденовируса, íóê-

16

леокапсид (ядерный материал и белковая оболочка) соприкасается с оболочкой, у других (вирусы гриппа и герпеса) — отделен мембраной. Строение некоторых видов вирусов представлено на рис. 1.1.

Рис. 1.1. Строение вирусов: à — аденовирус; á — герпес-вирус

Белковый капсид состоит из субъединиц — капсомеров èëè мономеров. Большинство вирусов имеют вид многогранников (кубическая симметрия), например икосаэдра (20 граней — 20 равных треугольников). Капсомеры вирусов могут быть двух типов: пентомеры (пять белковых мономеров) и гексамеры (шесть белковых мономеров).

Являясь внутриклеточными паразитами, вирусы вызывают заболевания у человека (грипп, оспа, бешенство, корь, полиомиелит), животных (ящур, чума крупного рогатого скота) и растений (мозаики и другие виды заболеваний полевых и огородных культур).

Специфической группой вирусов являются вирусы бактерий — бактериофаги, поражающие растения и микроорганизмы и вызывающие лизис (растворение) клеток. В зависимости от организма, на который они действуют, вирусы имеют различные названия: актинофаги, микофаги, цианофаги, фитофаги. Впервые лизис бактерий, вызывающих сибирскую язву, наблюдал Н. Ф. Гамалея в 1898 году. Подобное явление у бактерий дизентерии было установлено в 1917 г. Д’ Эреллем. Он назвал вирус, поражающий бактерий, бактериофагом (пожирателем бактерий).

17

Строение бактериофага. Электронная микроскопия показывает наличие у большинства фагов округлой или многогранной «головки», внутри которой заключена ДНК, реже РНК. Размеры головки составляют от 40 до 100 нм. Головка бактериофага переходит в отросток, представляющий собой белковый полый внутри стержень, окруженный сократительным чехлом из белка. Стержень оканчивается пластинкой с выростами и тонкими нитями. Существуют фаги, состоящие из одной головки, и фаги, имеющие форму палочки (ВТМ) (рис. 1.2).

Рис. 1.2. Строение бактериофага и вируса: à — бактериофаг: 1 — головка; 2 — ÄÍÊ; 3 — отросток; 4 — стержень; 5 — сократительный чехол отростка; 6 — пластинка отростка; 7 — волокна; á — ÂÒÌ

Фаги фильтруются через бактериальные фильтры и способны размножаться только в живых клетках.

В настоящее время изучен механизм проникновения фага в клетки бактерий. Бактериофаг пластинкой отростка прикасается к клетке, адсорбируется на ее поверхности, и стержень как бы прокалывает оболоч- ку клетки. Разрыв оболочки обусловлен наличием в конце отростка фага специфических ферментов. Белковый чехол отростка сокращается, и заключенная в головке нуклеиновая кислота по каналу отростка «впрыскивается» в бактериальную клетку. Она вызывает перестройку обмена веществ пораженной клетки и синтезирует фаговые, а не клеточные белки,

18

что приводит к образованию в клетке новых фагов. Оболочка клетки лизирует, фаги освобождаются и поражают новые клетки бактерий. Белковые оболочки головки и отростка остаются на поверхности клетки.

Фаги широко распространены в природе, они обладают специфич- ностью, т. к. действуют на определенный вид или на группу родственных видов микроорганизмов. Бактериофагия нарушает технологические микробиологические процессы, вызывая лизис молочнокислых бактерий, входящих в состав заквасок, используемых при изготовлении кисломолочных продуктов.

Некоторые фаги используют в медицине для профилактики или ле- чения дизентерии и холеры. Фаги являются объектами и моделями, служащими для изучения различных проблем теоретического и прикладного значения в общей и молекулярной биологии, биохимии, генетике, медицине и др.

Риккетсии (Rickettsiaceae)

Эти организмы названы в честь ученого Х. Т. Риккетса, открывшего и описавшего их как возбудителей пятнистой лихорадки Скалистых гор. Риккетсии представляют собой бактериоподобные организмы, видимые в световой микроскоп. Они сочетают признаки истинных бактерий и вирусов и занимают промежуточное положение между ними. Риккетсии — неподвижные организмы, естественными местами их обитания — резерватами (лат. reservare — сохранять) — являются членистоногие насекомые: клещи, пухоеды, блохи, вши, для которых они являются безвредными паразитами, или симбионтами. Риккетсии размножаются попереч- ным делением. Попав в организм животных или человека через укус или экскреции платяных и головных вшей, они вызывают тяжелые заболевания: траншейную лихорадку, патологические сыпи (тиф).

Бактерии (Bacteria)

Это самая многочисленная группа микроорганизмов. Морфологиче- ские и физиологические признаки истинных бактерий, особенности их метаболизма подробно излагаются в последующих главах, поэтому рассмотрим другие группы бактерий.

Нитчатые бактерии. Нити этих бактерий состоят из коротких цилиндрических клеток, окруженных тонкой слизистой оболочкой, образующих влагалище — чехол. Диаметр нити составляет 1–7 мкм. Размножение бактерий происходит с помощью особых клеток — гонидий, раз-

19

вивающихся из концевых клеток нити. Гонидии могут иметь жгутики. В благоприятных условиях гонидии прорастают в новые нити. В пределах влагалища клетки размножаются делением.

Нитчатые бактерии обитают преимущественно в воде, встреча- ются в почве.

Коринебактерии. Они имеют форму палочек, но обладают морфологической изменчивостью,

или плеоморфизмом (греч. pleion — разнообразные по форме). При делении коринебактерий скорость разрыва оболочки неодинакова и до- черние клетки приобретают различную форму (в виде булавы или прищепок для белья) (рис. 1.3). Среди коринебактерий встречаются возбудители дифтерии. Большинство представителей является аэробами. Они обитают в почве, где происходит деструкция органических веществ. Коринебактерии занимают промежуточное положение между бактериями и микобактериями.

Микобактерии. В морфологическом отношении представляют собой переходную группу от бактерий к проактиномицетам и актиномицетам. Способны временно образовывать мицелий (грибницу) (рис. 1.4), который распадается на палочки, имеющие неправильную форму, иногда ветвящиеся; лишены подвижности. Микобактерии широко распространены в почве. Многие виды способны использовать в качестве источника питания ароматические углеводороды и парафины. Они являются кислотоустойчивыми организмами.

Проактиномицеты (род Nocardia)

20