Микробиология и основы биотехнологии

Рис. 7.2. Схема основных этапов и операций типичного аэробного микробиологического процесса

Если требования к элементному составу питательных веществ определены, то понадобится выбрать конкретные соединения, содержащие необходимые для клеточного роста элементы.

Многие применяемые в промышленности микроорганизмы являются хемогетеротрофами, потребности которых в энергии и углероде удовлетворяются простыми сахарами. В промышленности в качестве источников энергии и углерода часто применяют неочищенные сахара и полупродукты (свеклосахарную, тростниково-сахарную или кукурузную мелассу, содержащую от 50 до 70 % ферментируемых сахаров). В качестве источ- ника углерода для микроорганизмов могут использоваться отходы консервного производства, сыворотка. Один из видов пищевых дрожжей

101

в промышленности получают путем роста культуры на побочном продукте бумажного производства — сульфитно-спиртовой барде, содержащей всего около 2 % способных к ферментации гексоз и пентоз.

К числу доступных для микрофлоры источников азота относятся аммиак, мочевина и нитраты. Микроорганизмы, продуцирующие протеолитические ферменты, могут усваивать азот из разнообразных источников, содержащих белки (пептоны, зерно хлебных злаков, фильтрат барды, мясные отходы, соевая мука, дрожжевые экстракты, казеин, кукурузный настой и др.). Для нормального роста и жизнедеятельности некоторых микроорганизмов необходимо наличие в питательной среде определенных аминокислот и факторов роста. В промышленных процессах потребность в необходимых факторах роста обеспечивается ка- ким-либо из полупродуктов, входящих в состав среды (кукурузный настой или дрожжевой автолизат).

Полупродукты часто являются источником минеральных веществ, необходимых для нормальной жизнедеятельности клеток.

Если основной целью процесса является синтез продукта жизнедеятельности микроорганизмов, то для повышения выхода или улучшения качества продукта к среде добавляются определенные вещества — предшественники. Молекула предшественника или его близкого производного

103

включается в молекулу продукта. В производствах новобиоцина, пенициллина G и витамина В12 в качестве предшественников используют бензойную кислоту, фенилуксусную кислоту, 5,6-диметилбензимидазол соответственно.

Асептические требования ведения аэробного микробиологического процесса

На практике микробиологические процессы и способы их ведения обусловлены различными требованиями к заражению системы вредными организмами. Если заражение вообще нежелательно, то процесс необходимо вести в асептических условиях при поддержании чистоты культуры. Например, при росте дрожжей в слабокислой среде или при ферментации углеводородов тщательно подобранными штаммами бактерий требования к соблюдению асептических условий могут быть несколько снижены, т. к. условия процесса сами по себе не стимулируют рост многих потенциально вредных микроорганизмов.

Последовательность операций, принятых в периодическом процессе, начинается с получения посевного материала (инокулянта) из чистой культуры.

Подготовка посевного материала. Сводится к полиферации, когда из небольшого числа клеток в строго контролируемых условиях получа- ют плотную суспензию, объем которой составляет от 1 до 20 % объема промышленного ферментера. Эта операция выполняется ступенчато путем постепенного увеличения масштаба. Исходным материалом служит чистая культура — тщательно поддерживаемая популяция данного штамма микроорганизма. Нужный штамм получают в результате многочисленных экспериментов, включающих выведение множества мутантов (организмы со стойкими наследственными изменениями), их скрининг (выбор клонов — основная единица учета однородных клеток в генетике) и селекцию (отбор).

Полученный таким способом штамм должен обладать рядом преимуществ и при его хранении необходимо обеспечить неизменность его генетической природы. Генетическая стабильность штамма микроорганизмов достигается за счет максимального снижения его метаболитиче- ской активности при хранении. Микроорганизмы сохраняют в состоянии покоя в частично обезвоженном виде. Обезвоживание осуществляют путем лиофилизации (сублимационная сушка) суспензии клеток в жидкости или путем тщательного высушивания дисперсии спор или клеток

104

в стерильной почве или песке. Склонные к мутациям организмы часто подвержены обратным мутациям или иным нежелательным генетиче- ским изменениям. В таких случаях важно регулярно контролировать чистоту культуры.

При использовании лиофилизованной культуры следующей стадией процесса получения посевного материала является приготовление суспензии клеток в стерильной жидкости. После чего каплю этой суспензии переносят на скошенный агар, приготовленный в наклоненной пробирке путем желатинизации с помощью агара стерильной питательной среды. Агар — полисахарид, выделяемый из водорослей. После инкубации, обеспечивающей достаточный рост культуры, клетки снова суспендируют в жидкости и наносят на агаровую поверхность большей площади в плоских сосудах Блейка или Ру или переносят во встряхиваемый сосуд. Эти сосуды устанавливают на качалках, обеспечивающих перемешивание за счет вращательного или вращательно-поступательно- го движения. Таким образом, достигается рост погруженной культуры, а также адекватное поступление кислорода в культуру и выведение газов из нее. Эту операцию (полиферацию) повторяют несколько раз с сосудами все больших объемов и только тогда переходят к следующей стадии. Все описанные операции переноса культуры должны выполняться в строго стерильных условиях: в специальных помещениях со стерильной атмосферой, асептическими условиями и температурным режимом.

Дальнейшая полиферация культуры осуществляется в небольших ферментерах, снабженных почти всеми контрольно-измерительными приборами, которые применяются в крупномасштабных процессах. В этих реакторах подбираются такие условия, которые обеспечивают максимальную скорость роста культуры.

На этой стадии получения посевного материала переходят от лабораторных ферментеров к заводским установкам и условиям [3]. К основным принципам и методам поддержания асептического режима, устройствам и операциям, применяющимся для достижения этой цели, относятся следующие:

–наличие устройств для проведения независимой стерилизации всех входящих в ее состав узлов и компонентов;

–перенос культуры из сосуда посевного материала в промышленный реактор должен осуществляться при соблюдении общих принципов асептического процесса;

105

–все клапаны системы должны быть доступны для проверки, чистки и стерилизации;

–особое внимание должно быть обращено на паронепроницаемость всех соединений системы;

–в системе должны быть полностью исключены любые контакты между стерильными и нестерильными зонами;

–предотвращение случайных утечек за счет поддержания в системе небольшого избыточного давления.

Промышленные ферментеры изготавливаются из нержавеющего материала, что существенно снижает возможность коррозии аппаратуры и сводит к минимуму опасность загрязнения культуральной жидкости нежелательными ионами металлов. В ферментере и элементах системы не должно быть застойных зон, щелей, трещин и участков, в которых могут накапливаться устойчивые к стерилизации твердые вещества, на которых микроорганизмы могут образовывать плотные скопления и пленки. В реакторе перемешивающее устройство должно обеспечивать перемешивание и аэрацию системы в необходимой степени.

Для исключения возможности заражения культуры при проектировании и в процессе эксплуатации реакторов особое внимание должно быть уделено асептическим уплотнениям.

Âлабораторных ферментерах обычно достаточно одной мешалки,

àв промышленных реакторах могут потребоваться несколько перемешивающих устройств.

До 70–80 % объема реактора занимает жидкая фаза, а верхнюю его часть заполняют газы. Перемешивание и аэрация жидкости способствуют образованию пены на ее поверхности, особенно если в среде в больших концентрациях присутствуют пептиды. Пена препятствует газообмену между культуральной жидкостью и находящимся над ней пространством. Выйдя из реактора, пена загрязняет систему, если составляющие пену пузырьки коалесцируют и образующаяся жидкая фаза вновь поступает в реактор. С целью снижения пенообразования над уровнем жидкой фазы устанавливают дополнительную мешалку, а для устойчивых пен к культуральной жидкости добавляют особые вещества — пеногасители, которые дестабилизируют пену в результате снижения поверхностного натяжения. Поверхностно-активные свойства пеногасителей могут явиться причиной снижения скорости переноса кислорода в реакторе.

106

При периодической стерилизации среды в самом ферментере змеевик теплообменника должен обеспечивать необходимые скорости нагревания

èохлаждения. Теплообменное устройство должно справляться с пиковыми нагрузками, куда входят тепловые эффекты микробиологического процесса, а также рассеяние теплоты, выделяющейся при перемешивании. Коэффициенты теплопередачи для неинокулированной среды примерно равны коэффициенту теплопередачи воды, в то время как плотная мицелиальная культура по этим характеристикам приближается к пастам.

Процесс в ферментере может продолжаться от суток до двух недель

èболее, например процесс биосинтеза антибиотика длится от 4 до 5 суток. В течение этого времени необходимо поддерживать строгий режим процесса, изменяя те или иные параметры в соответствии с определенной программой.

7.3. Характеристика основных стадий биотехнологического производства

Биотехнологическая стадия — основная стадия микробиологиче- ского процесса, на которой с использованием того или иного биологиче- ского агента (микроорганизмов, изолированных клеток, ферментов, клеточных органелл) происходит преобразование сырья в конечный продукт. Главной задачей биотехнологической стадии является получение определенного органического вещества. Эта стадия может включать ряд других технологических процессов:

ферментация — процесс, осуществляемый с помощью культивирования микроорганизмов;

биотрансформация, в процессе которой происходит изменение химической структуры вещества под действием ферментативной активности клеток микроорганизмов или готовых ферментов. В этом процессе не происходит увеличения клеток микроорганизмов, а химическая структура вещества изменяется незначительно;

биокатализ — химические превращения вещества, протекающие с использованием ферментов — биокатализаторов;

биодеградация — биодеструкция загрязняющих веществ микроорганизмами или их ассоциациями в аэробных условиях;

метановое брожение — переработка органических отходов метаногенными микроорганизмами в анаэробных условиях;

биокомпостирование — деструкция вредных органических веществ ассоциациями микроорганизмов в твердых отходах;

107

биосорбция — сорбция вредных примесей из газов или жидкостей микроорганизмами, закрепленными на специальных носителях;

бактериальное выщелачивание — процесс перевода нерастворимых

âводе соединений металлов в растворенное состояние под действием специальных микроорганизмов.

Стадия разделения жидкости и биомассы. Целевой продукт, чаще находящийся в самой биомассе или в жидкости, в зависимости от свойств биомассы и жидкости, необходимо разделить на фазы. Для этой цели используются различные процессы:

отстаивание — разделение под действием гравитационных сил (обычно при очистке сточных вод);

фильтрация — пропускание суспензии через фильтрующий материал, на котором задерживаются частицы твердой фазы — биомасса. Способ применяют в производстве антибиотиков и в тех случаях, когда микроорганизм — продуцент — имеет мицелиальную структуру;

сепарация, центрифугирование — разделение под действием центробежных сил. Используется для отделения дрожжей или бактерий

âпроизводстве биомассы;

микрофильтрация, ультрафильтрация — пропускание суспензии через мембраны с весьма малым размером пор, обеспечивающее удержание клеток микроорганизмов на мембране и получение раствора, не содержащего взвешенных клеток. В процессе ультрафильтрации задерживаются не только клетки, но и крупные молекулы растворенных веществ;

коагуляция — добавление в суспензию реагентов, способствующих образованию и осаждению более крупных клеточных агломератов и отделению их от жидкости путем отстаивания;

флотация — захват биомассы микроорганизмов пузырьками пены и выделение ее из пенной фракции.

Стадия выделения продуктов биосинтеза связана с внутриклеточ- ными и внеклеточными продуктами.

Для извлечения внутриклеточных продуктов необходимо разрушить клеточную оболочку путем дезинтеграции клеток. Этот процесс разрушения клеточной оболочки может осуществляться физическими,

àтакже физико-химическими и биотехнологическими методами.

Êфизическим методам относятся: замораживание, воздействие ультразвуком, декомпрессия — резкий сброс давления.

108

К физико-химическим методам относятся:

гидролиз — разрушение клеточных оболочек под действием химиче- ских реагентов и температуры;

экстракция — переход целевого продукта из водной фазы в несмешивающуюся с водой органическую жидкость (экстрагент). В качестве экстрагентов могут использоваться бензин, хлороформ, эфир, бутилацетат. Экстракция непосредственно из твердой фазы (в том числе и биомассы микроорганизмов) называется экстрагированием;

осаждение — выделение целевого продукта путем добавления к жидкости реагента, взаимодействующего с растворенным продуктом и переводящим его в твердую фазу;

адсорбция — перевод растворенного в жидкости продукта в твердую фазу путем его сорбции на специальных твердых носителях (сорбентах);

ионный обмен — в твердую фазу катионита или анионита переходят ионы (катионы и анионы), а не целиком молекула целевого продукта или примеси;

отгонка, ректификация — используются для выделения растворенных в культуральной жидкости легкокипящих продуктов (этиловый спирт);

ультрафильтрация, нанофильтрация и обратный осмос применяются для выделения высокомолекулярных соединений (белков, полипептидов, полинуклеотидов). Нанофильтрация и обратный осмос позволяют отделять даже небольшие по размеру молекулы;

центрифугирование, ультрацентрифугирование используют для выделения вирусов, клеточных органелл, высокомолекулярных соединений.

К биотехнологическим методам относятся:

ферментолиз — разрушение клеточных оболочек под действием ферментов при повышенной температуре;

автолиз — разновидность ферментолиза, когда используются для растворения клетки собственные клеточные ферменты.

После проведения предварительной операции по разрушению клеток выделение целевого продукта из раствора осуществляется для внутриклеточных и внеклеточных продуктов общими методами.

Стадия очистки продукта. Для получения биопродукта высокой кондиции необходима стадия очистки продукта, задачей которой является удаление примесей, что позволяет максимально очистить продукт. Эта задача решается с помощью разнообразных процессов, которые были рассмотрены ранее — экстракция и экстрагирование, адсорбция, ион-

109

ный обмен, ультрафильтрация и обратный осмос, ректификация и ферментолиз. Кроме этих процессов используют и другие методы:

хроматографию — процесс, напоминающий адсорбцию. Несколько растворенных веществ, близких по структуре (смеси белков, нуклеотидов, сахаров, антибиотиков), собираются на твердом сорбенте и выходят из него после обработки различными растворителями по очереди, что позволяет разделить вещества и очистить друг от друга;

диализ — процесс, при котором низкомолекулярные вещества могут проходить через полупроницаемую перегородку. Путем диализа осуществляют очистку вакцин и ферментов от солей и низкомолекулярных растворимых примесей;

кристаллизацию — процесс, основанный на различной растворимости веществ при разных температурах. При медленном охлаждении образуются кристаллы вещества с высокой степенью очистки (например, кристаллы пенициллина).

Стадия концентрирования продукта. На выходе из биотехнологи- ческой стадии целевой продукт в суспензии составляет 0,1–1,0 %, после стадии отделения биомассы — 0,1–2,0 %, после стадии выделения — 1,0–10,0 %, после очистки — 50,0–80,0 %, после концентрирования — 90,0–100,0 %.

На стадии концентрирования продукта применяют процессы: выпаривание, сушка, осаждение, кристаллизация с фильтрацией получившихся кристаллов, ультрафильтрация и гиперфильтрация или нанофильтрация.

Получение готовой формы продукта. На завершающей стадии основного биотехнологического производства продукт приобретает товарную форму за счет проведения процессов гранулирования (формирование гранул из порошка или прямо из раствора), дражирования, таблетирования (формирование драже, таблеток), розлива èëè фасовки, ампулирования (запаивание в ампулы).

7.4. Виды продуктов по их месту в типовой технологической схеме

Полученные в биотехнологическом процессе различные виды продуктов отличаются не только по органолептическим свойствам, химиче- скому составу, но и по месту, занимаемому в типовой технологической схеме [19].

110