merged(1)

ГБОУ ВПО “Уральский государственный медицинский университет” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Методические указания №2 к практическим занятиям для студентов

ООП специальности 060101.65 Лечебное дело Дисциплина С2.Б.10 Микробиология, вирусология

1.Тема: Структура бактериальной клетки. Бактериоскопический метод.

2.Цели занятия: Изучить со студентами структуру бактериальной клетки. Ознакомить студентов с назначением бактериоскопического метода. Познакомить студентов с простыми и сложными методами окраски бактерий. Обучить студентов технике окраски бактерий по Граму. Познакомить студентов с техникой микроскопирования бактерий в живом состоянии.

3.Задачи занятия:

3.1.Изучение студентами структуры бактериальной клетки.

3.2.Ознакомление студентов с принципами и назначением бактериоскопического метода исследования.

3.3.Изучение студентами простых и сложных методов окраски бактерий.

3.4.Освоение студентами метода окраски бактерий по Граму.

3.5.Овладение студентами техникой микроскопирования бактерий в живом состоянии.

2

4.Продолжительность занятия в академических часах: 3 часа.

5.Контрольные вопросы по теме:

5.1. Основные структурные элементы бактериальной клетки, их функции.

5.2. Особенности строения клеточной стенки. Строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.

5.3.Спорообразование у бактерий.

5.4.Включения в цитоплазму бактериальной клетки.

5.5.Простые методы окраски микробов.

5.6.Сложные методы окраски микробов (методы Грама, Циля-Нильсена, БурриГинса, Ожешко). Методы обнаружения капсул, жгутиков, спор бактерий.

5.7.Сущность окраски микробов по Граму.

5.8.Техника приготовления мазков на предметных стеклах. Техника приготовления двух и более мазков на одном стекле.

5.9.Техника окраски микробов по Граму. Распределение микроорганизмов на группы в зависимости от окраски по Граму.

5.10.Методы изучения микробов в живом состоянии.

6. Задания и методические указания к их выполнению.

На занятии студенту необходимо выполнить:

6.1.Ответить на вопросы преподавателя.

6.2.Принять участие в обсуждении изучаемых вопросов.

6.3.Выполнить самостоятельную работу.

Теоретическая справка.

Структура бактериальной клетки.

Структурные компоненты бактериальной клетки делят на 2 вида:

3

-основные структуры (клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана с

еепроизводными, цитоплазма с рибосомами и различными включениями, нуклеоид);

-временные структуры (капсула, слизистый чехол, жгутики, ворсинки, эндоспоры, образующиеся лишь на определенных этапах жизненного цикла бактерий).

Основные структуры.

Клеточная стенка находится с внешней стороны от цитоплазматической мембраны. Функции клеточной стенки:

-защита бактерий от осмотического шока и других повреждающих

факторов;

-определение формы бактерий;

-участие в метаболизме бактерий;

-токсичность за счет наличия поверхностных антигенов (у некоторых патогенных бактерий);

-наличие рецепторов для бактериофагов (у части бактерий).

В 1884 году датский микробиолог Ганс Христиан Грам предложил метод окраски бактерий с использованием генцианвиолета, йода, этилового спирта и фуксина. Все бактерии в зависимости от окраски по Грамму подразделяют на 2 группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии.

Клеточная стенка грамположительных бактерий состоит из одного толстого слоя пептидогликана и тейхоевых кислот. Пептидогликан (муреин) – это многослойный линейный полимер, в котором чередуются остатки N- ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина. У грамположительных бактерий содержание пептидогликана составляет от 50 до 90%. Слои пептидогликана связаны (прошиты) между собой тейхоевой и липотейхоевой кислотами. Тейхоевые кислоты выступают на поверхности клеточной стенки и являются главными антигенами грамположительных бактерий. Клеточная стенка грамположительных бактерий плотно прилегает к цитоплазматической мембране, ее толщина составляет

20-100 нм.

Грамположительные бактерии прочно фиксируют комплекс генцианвиолета и йода, не обесцвечиваются этанолом и поэтому не воспринимают дополнительный краситель фуксин, в результате чего клетка остается окрашенной в фиолетовый цвет.

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий состоит из 2-х тонких слоев. Внутренний слой (периплазма) представлен пептидогликаном в виде тонкой непрерывной сетки. У грамотрицательных бактерий содержание пептидогликана составляет 1-10%. Наружный слой (внешняя мембрана) состоит из липополисахарида, белков и фосфолипидов. Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий составляет 14-17 нм. Липополисахариды всех грамотрицательных бактерий обладают токсическими и пирогенными свойствами и называются эндотоксинами. У грамотрицательных бактерий комплекс генцианвиолета с йодом легко вымывается из клетки этанолом, и после дополнительного нанесения фуксина клетка окрашивается в красный цвет.

В некоторых условиях бактерии лишаются способности полностью или частично синтезировать компоненты клеточной стенки, в результате чего

4

образуются протопласты, сферопласты и L-формы бактерий. Сферопласты – это бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой с сохранением элементов наружной мембраны. Они наблюдаются у грамотрицательных бактерий. Протопласты - это формы, полностью лишенные клеточной стенки. Они образуются грамположительными бактериями. L-формы бактерий - это мутанты бактерий, частично или полностью утратившие способность синтезировать пептидогликан клеточной стенки (бактерии с дефектной клеточной стенкой). Свое название они получили от названия института Листера в Англии, где были открыты в 1935 году.

Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) и ее производные.

Цитоплазматическая мембрана - это полупроницаемая липопротеидная структура бактериальной клетки, отделяющая цитоплазму от клеточной стенки. Она составляет 8-15% сухой массы клетки. Ее разрушение приводит к гибели клетки. При электронной микроскопии выявлено ее трехслойное строение. Цитоплазматическая мембрана представляет собой комплекс белков (50-75%) и липидов (15-20%). Основная масса липидов представлена фосфолипидами. Кроме того, в составе мембраны обнаружено небольшое количество углеводов.

ЦПМ бактерий выполняет следующие функции:

-барьерная функция (молекулярное “сито”);

-избирательный перенос различных органических и неорганических молекул и ионов с помощью специальных переносчиков – транслоказ или пермеаз;

-превращение клеточной энергии;

-репликация и последующее разделение неклеоида.

В процессе роста клетки цитоплазматическая мембрана образует многочисленные впячивания (инвагинаты), получившие название мезосом. По морфологическим особенностям различают ламеллярные (пластинчатые), везикулярные (имеющие форму пузырьков), тубулярные (трубчатые) мезосомы.

Цитоплазма - это содержимое бактериальной клетки, ограниченное цитоплазматической мембраной. Она состоит из цитозоля и структурных элементов.

Цитозоль - гомогенная фракция, включающая РНК, ферменты, продукты метаболизма.

Структурные элементы - это нуклеоид, рибосомы, включения и внутрицитоплазматические мембраны.

Нуклеоид является аналогом ядра. Он состоит из одной замкнутой в кольцо двуспиральной нити ДНК, которую рассматривают как бактериальную хромосому. У нуклеоида отсутствует ядерная оболочка.

Кроме нуклеоида в бактериальной клетке обнаружены внехромосомные генетические элементы – плазмиды, которые представляют собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, способные к автономной репликации. Роль плазмид состоит в том, что они кодируют дополнительные признаки, дающие клетке преимущества в определенных условиях существования. Наиболее распространены плазмиды, детерминирующие признаки антибиотикорезистентности бактерий (R- плазмиды), синтез энтеротоксинов (Ent-плазмиды) или гемолизинов (Hlyплазмиды).

Рибосомы - органоиды, осуществляющие биосинтез белка. Они состоят из белка и РНК. Представляют собой гранулы диаметром 15-20 нм. Одна

7

- бациллы и клостридии (спорообразующие палочки);

-микобактерии, коринебактерии и листерии.

2. Грамотрицательные бактерии:

-некоторые кокки (гонококки и менингококки);

-все остальные палочковидные бактерии;

-все извитые формы (вибрионы, спириллы, спирохеты).

Методы выявления капсул, жгутиков, спор.

Для выявления некоторых бактерий и отдельных структур клеток применяют

специальные методы окраски.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена:

1.На фиксированный мазок наносят карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 3-5 минут.

2.Снимают бумагу пинцетом, промывают мазок водой.

3.На мазок наносят 5% раствор серной кислоты или 3% раствор солянокислого спирта на 1-2 минуты для обесцвечивания.

4.Промывают водой.

5.Докрашивают мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-

5 минут.

6.Промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Выявление капсулы по методу Гинса:

1.На предметное стекло наносят каплю туши, а рядом – каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно перемешивают и с помощью шлифованного стекла готовят мазок вдоль предметного стекла.

2.Мазок высушивают на воздухе и фиксируют на пламени горелки.

3.Мазок окрашивают фуксином в разведении 1:3 или сафранином. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы остаются неокрашенными и выделяются на темном фоне препарата.

Окраска жгутиков по Леффлеру:

1.Взвесь бактерий переносят в каплю воды, не перемешивают и высушивают.

2.Обрабатывают препарат 15-20 минут протравой (1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина + смесь из 10 мл 25% водного раствора танина с 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа).

3.Тщательно промывают водой и высушивают на воздухе.

4.Докрашивают фуксином Циля в течение 3-4 минут при легком подогревании.

5.Промывают водой, высушивают, микроскопируют.

Окраска спор по методу Ожешки:

1.На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2-3 минут.

2.Кислоту сливают, препарат промывают водой, просушивают и фиксируют над пламенем горелки.

3.Окрашивают препарат по Цилю-Нильсену. Споры бактерий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.

Изучение микробов в живом состоянии.

8

Клетки микроорганизмов в живом состоянии изучают методом раздавленной капли и методом висячей капли.

Метод раздавленной капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за края покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом х40. Метод раздавленной капли удобен для исследования подвижности бактериальных клеток, а также для изучения крупных микроорганизмов - плесневых грибов, дрожжей.

Метод висячей капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят каплю бактериальной суспензии. Затем предметное стекло с лункой, края которого предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Препарат переворачивают покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии используют вначале малый сухой объектив х8, под увеличением которого находят края капли, а затем устанавливают объектив х40 и исследуют препарат.

После обсуждения теоретических вопросов преподаватель объясняет правила проведения самостоятельной работы.

Самостоятельная работа: приготовление препаратов из жидких и агаровых культур грамположительных и грамотрицательных бактерий и их смеси, окраска по методу Грама, микроскопирование с иммерсионной системой, зарисовка результатов в рабочей тетради.

7. Оценивание знаний, умений, навыков по теме занятия:

Ответы на вопросы и активность на занятии оцениваются по 5-балльной системе.

8. Литература для подготовки:

8.1.Основная:

1.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Под ред. А.А. Воробьева. Учебники и учеб. пособия для высшей школы. Издательство: Медицинское информационное агентство, 2012. – 702 с.

2.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 1 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 448 с.: ил.

3.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 2 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 480 с.: ил.

8.2.Дополнительная:

9

1.Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для студентов мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - 5-е изд., испр. и

доп. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 759 с.: ил.

2.Медицинская микробиология: учебник. 4-е изд. Поздеев О.К. / Под ред. В.И. Покровского. – 2010. – 768 с.

3.Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга 1 / Колл. авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Волиной Е.Г. – М.: Издательство БИНОМ, 2008. – 1080 с.: ил.

Методические указания переработаны и дополнены профессором Литусовым Н.В.

Обсуждены на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.

ГБОУ ВПО “Уральский государственный медицинский университет” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Методические указания №3 к практическим занятиям для студентов

ООП специальности 060101.65 Лечебное дело Дисциплина С2.Б.10 Микробиология, вирусология

1.Тема: Стерилизация. Дезинфекция. Питание бактерий.

2.Цели занятия: Изучить со студентами методы и режимы стерилизации. Ознакомить студентов с основными группами дезинфицирующих и антисептических веществ, механизмом их антибактериального действия. Познакомить студентов с классификацией питательных сред и их использованием в микробиологической практике. Обучить студентов технике посева микроорганизмов в жидкие и на плотные питательные среды.

3.Задачи занятия:

3.1.Изучение действия физических и химических факторов на микроорганизмы.

3.2.Ознакомление с принципами и методами стерилизации.

3.3.Ознакомление с основными группами дезинфицирующих и антисептических веществ, механизмом их антибактериального действия.

3.4.Изучение механизмов поступления питательных веществ в бактериальную клетку.

3.5.Ознакомление с микробиологическими питательными средами.

3.6.Овладение техникой посева микроорганизмов в жидкие и на плотные питательные среды.