merged(1)

6

3.Факультативные анаэробы могут расти как в присутствии кислорода, так и в анаэробных условиях (кишечная палочка).

4.Облигатные (строгие) анаэробы могут расти только при полном отсутствии кислорода в окружающей среде (возбудители столбняка, ботулизма, газовой гангрены).

Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов. Физические методы:

1.Выращивание в средах под слоем вазелинового масла. Для удаления растворенного кислорода среды кипятят в течение 15-20 минут на водяной бане, затем быстро охлаждают до 45-50°С.

2.Посев в “высокий столбик агара”. Питательную среду разливают в пробирки по 10 мл и прогревают на кипящей водяной бане для удаления кислорода, после чего охлаждают до температуры 45°С и вносят исследуемый материал.

3.Выращивание в анаэростатах.

Химические методы:

1.Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде

2.Применение гидросульфита натрия для поглощения кислорода из замкнутого пространства.

3.Использование редуцирующих веществ (сред с редуцирующими веществами) - тиогликолевой кислоты, аскорбиновой кислоты, цистина и цистеина (тиогликолевой среды, среды Китта-Тароцци, мозговой среды Гиблера).

4.Применение газогенерирующих систем в микроанаэростатах,

эксикаторах, прозрачных газонепроницаемых пластиковых пакетах: водород генерируется таблетками боргидрида натрия, углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия.

Биологические методы:

1.Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера) –

выращивание на одной половине чашки Петри анаэробов, а на другой – аэробов.

2.Добавление в питательную среду кусочков печени, головного мозга,

почек и других внутренних органов, поглощающих и адсорбирующих на себе кислород.

3.Использование лабораторных животных. Культуры некоторых облигатных анаэробов можно поддерживать путем пассажа на лабораторных животных, однако в настоящее время этот метод используется достаточно редко.

Методы выделения чистых культур облигатных анаэробов:

Метод Цейсслера – рассев штрихом по поверхности плотной питательной среды, выращивание в анаэробных условиях при 37°С в течение 24-72 часов.

Метод Вейнберга – последовательные разведения материала с помощью запаянного капилляра в охлажденном до 45-50°С сахарном агаре.

Метод Вейона-Виньяля – выращивание культуры в 0,5% агаре в капиллярах пастеровских пипеток.

Метод Перетца – выращивание культуры в 0,5% расплавленном агаре в чашке Петри под стеклянной пластинкой размером 6х6 см, расположенной на двух стеклянных или деревянных палочках.

7

Метод “перевернутых чашек” (разновидность метода Перетца) – выращивание культуры на агаре, разлитом в крышку чашки Петри. Сверху крышку закрывают стерильным донышком чашки. Щель между краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафином.

После обсуждения теоретических вопросов преподаватель объясняет порядок выполнения самостоятельной работы.

Самостоятельная работа:

1.Оформление в рабочей тетради схем выделения анаэробных бактерий.

2.Учет результатов изучения сахаролитической активности бактерий с использованием демонстрационных “пестрых рядов”.

7.Оценивание знаний, умений, навыков по теме занятия:

Ответы на вопросы и активность на занятии оцениваются по 5-балльной системе.

8. Литература для подготовки:

8.1.Основная:

1.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Под ред. А.А. Воробьева. Учебники и учеб. пособия для высшей школы. Издательство: Медицинское информационное агентство, 2012. – 702 с.

2.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 1 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 448 с.: ил.

3.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 2 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 480 с.: ил.

8.2.Дополнительная:

1.Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для студентов мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - 5-е изд., испр. и

доп. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 759 с.: ил.

2.Медицинская микробиология: учебник. 4-е изд. Поздеев О.К. / Под ред. В.И. Покровского. – 2010. – 768 с.

3.Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга 1 / Колл. авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Волиной Е.Г. – М.: Издательство БИНОМ, 2008. – 1080 с.: ил.

Методические указания переработаны и дополнены профессором Литусовым Н.В.

Обсуждены на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.

ГБОУ ВПО “Уральский государственный медицинский университет” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Методические указания №6 к практическим занятиям для студентов

ООП специальности 060101.65 Лечебное дело Дисциплина С2.Б.10 Микробиология, вирусология

1.Тема: Вирусы, их структура. Вирусы бактерий – фаги. Фаги вирулентные и

умеренные, их взаимодействие с бактериальной клеткой. Изменчивость микроорганизмов. Фенотипическая и генотипическая изменчивость.

2.Цели занятия: Изучить со студентами структуру вирусов и бактериофагов, их взаимодействие с клетками, фенотипическую и генотипическую изменчивость бактерий.

3.Задачи занятия:

3.1.Изучение структуры вирусов и их взаимодействия с клетками.

3.2.Изучение структуры бактериофагов и их взаимодействия с бактериальными клетками.

3.3.Изучение форм фенотипической изменчивости бактерий.

3.4.Изучение форм генотипической изменчивости бактерий.

3.5.Выполнение самостоятельной работы.

2

4.Продолжительность занятия в академических часах: 3 часа.

5.Контрольные вопросы по теме:

5.1.Структура вирусов и их взаимодействие с клетками.

5.2.Структура бактериофагов и их взаимодействие с бактериями.

5.3.Вирулентные и умеренные бактериофаги.

5.4.Фенотипическая изменчивость микроорганизмов.

5.5.Генотипическая изменчивость микроорганизмов.

6. Задания и методические указания к их выполнению.

На занятии студенту необходимо выполнить:

6.1.Ответить на вопросы преподавателя.

6.2.Принять участие в обсуждении изучаемых вопросов.

6.3.Выполнить самостоятельную работу.

Теоретическая справка. Структура вирусов.

Вирусы – это микроорганизмы, не имеющие клеточного строения, проходящие через бактериальный фильтр и не способные к росту вне живых клеток. Элементарной сформировавшейся вирусной частицей является вирион.

Морфологию вирусов изучают с помощью электронной микроскопии, так как их размеры малы (18 - 400 нм).

Форма вирионов:

- палочковидная (вирус табачной мозаики);

3

-пулевидная (вирус бешенства);

-сферическая (герпесвирусы, ВИЧ);

-нитевидная (филовирусы);

-овальная (вирус оспы);

-в виде сперматозоида (многие вирусы бактерий - бактериофаги). Химический состав всех вирусов представлен белками и нуклеиновыми

кислотами (ДНК или РНК). Вирусы средних и крупных размеров содержат также липиды и углеводы. Белки составляют от 49,1 до 89%, нуклеиновые кислоты - от 3,5 до 40% всей массы вирусов.

Вирусы состоят из центральной части – нуклеиновой кислоты (генома) и белковой оболочки – капсида. Капсид состоит из отдельных структурных единиц – капсомеров. Геном вирусов представлен РНК или ДНК. Поэтому выделяют РНКсодержащие вирусы и ДНК-содержащие вирусы. Различают просто устроенные вирусы и сложно устроенные вирусы. У просто устроенных вирусов нуклеиновая кислота окружена капсидом, образуя нуклеокапсид. Сложно устроенные вирусы имеют суперкапсид - дополнительную оболочку. Суперкапсид состоит из двойного слоя липидов и специфических вирусных белков.

Под оболочкой некоторых вирусов находится матриксный М-белок. Это белок способствует взаимодействию суперкапсида с нуклеокапсидом.

Вирусные белки делятся на структурные и неструктурные. Структурными называются белки, входящие в состав зрелых внеклеточных вирионов. Неструктурные белки – это белки, кодируемые вирусным геномом, но не входящие в состав вириона. Они участвуют в репродукции вирусов внутри инфицированной клетки.

По признаку симметрии вирусы делятся на 3 группы:

I группа - вирусы, имеющие спиральный тип симметрии. Он характерен для вирусов крупных размеров (рабдовирусы, вирусы гриппа, парагриппа, коронавирусы). Капсомеры уложены в спирали одинакового диаметра. Витки спирали тесно прилегают друг к другу, образуя трубочку. Укладка спиралей определяет форму вирусных частиц (палочковидная, пулевидная или нитевидная).

II группа - вирусы, имеющие кубический тип симметрии, называют сферическими. Такой тип симметрии имеют аденовирусы, пикорнавирусы (вирусы герпеса, ящура, полиомиелита).

III группа - комбинированный тип симметрии характерен для бактериофагов (головка имеет кубический тип симметрии, а хвостовой отросток – спиральный тип симметрии).

Вирусы бактерий – фаги. Бактериофаги – это вирусы бактерий. Выделяют 5 основных типов бактериофагов в зависимости от типа нуклеиновых кислот (ДНКсодержащие и РНК-содержащие фаги), строения, типа симметрии:

1.Нитевидные фаги с длинным отростком.

2.Фаги с аналогом отростка.

3.Фаги с коротким отростком.

4.Фаги с несокращающимся отростком.

5.ДНК-содержащие фаги с сокращающимся чехлом отростка, заканчивающимся базальной пластинкой.

Строение бактериофагов:

4

1.Головка имеет кубический тип симметрии, состоит из белковой оболочки, построенной из отдельных субъединиц и заключенного в ней генома. Размеры головки около 100 нм. Геном фагов образован спирально упакованной двойной нитью ДНК.

2.Отросток (хвост) фагов имеет спиральную симметрию, длину около 100 нм, включает полый стержень и сократительный чехол. В дистальном отделе стержня расположена 6-угольная базальная пластинка с 6 шипами и 6 отростками (фибриллами). У некоторых фагов в дистальной части имеется лизоцим.

Бактериофаги более устойчивы к физическим и химическим воздействиям, чем вирусы человека. Они хорошо переносят высокие температуры (50-60ОС), действие дезинфицирующих веществ, УФ-облучение в низких дозах.

Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой:

1.Адсорбция на бактериальной клетке происходит за счет наличия на ее поверхности специфических рецепторов для бактериофага. На бактериях, лишенных клеточной стенки, адсорбция не происходит. Обратимая фаза адсорбции характеризуется тем, что фиксированные частицы фага можно отделить от клетки путем энергичного перемешивания, встряхивания или резкого уменьшения концентрации ионов. При необратимой фазе адсорбции фаг не может быть отделен от бактериальной клетки.

2.Внедрение вирусной ДНК (инъекция фага) происходит путем расщепления фрагмента клеточной стенки лизоцимом, который содержится в капсиде фага. Чехол сокращается, и вирусная ДНК впрыскивается в цитоплазму. Фаговая частица в клетку не проникает.

3.Репродукция фага протекает в 3 этапа:

1)репликация нуклеиновых кислот;

2)синтез фаговых белков;

3)сборка фаговых частиц.

Весь процесс репродукции протекает в течение 3-10 часов в зависимости от вида фага.

Бактериофаги подразделяются на вирулентные и умеренные.

Вирулентные бактериофаги имеют непрерывный цикл репродукции. Через 30 минут от момента инфицирования в бактериальной клетке образуется около 100 вирусных частиц, происходит лизис клетки, и фаговое потомство выходит в окружающую среду.

ДНК умеренных бактериофагов после попадания в цитоплазму способна встраиваться (интегрироваться) в геном бактериальной клетки и существовать в форме профага неопределенно долго, не проявляя активности (интегративная форма инфекции). В результате делений все потомство инфицированной клетки имеет в своем геноме профаг. Явление встраивания фаговой ДНК в бактериальный геном называется лизогенией, а зараженная умеренным фагом бактериальная культура называется лизогенной культурой.

Под влиянием некоторых физических (ультрафиолетовое облучение) или химических факторов может происходить активация умеренного фага. Активация сопровождается синтезом фаговой иРНК, ДНК и белков с последующей сборкой дочерних фаговых частиц, лизисом бактериальной клетки и выходом фагового потомства в окружающую среду.

6

называются мутантами. Различают спонтанные и индуцированные мутации, генные (изменение одного гена) и хромосомные (изменение двух или более участков хромосомы).

1.1.Спонтанные (самопроизвольные) мутации возникают под влиянием неизвестных причин. Пример - ауксотрофность, то есть утрата способности к синтезу какого-либо соединения.

1.2.Индуцированные (направленные) мутации проявляются в результате обработки микроорганизмов мутагенами (химическими веществами, физическими факторами - температурой, ультрафиолетовым и ионизирующим излучениями и др.).

2. Генетические рекомбинации – изменение признаков в результате генетического обмена между клетками-донорами и клетками-реципиентами.

2.1.Трансформация (преобразование, перестройка) - изменение генома реципиента в результате поглощенного из среды свободного фрагмента ДНК донора.

2.2.Трансдукция - передача ДНК от клетки-донора клетке-реципиенту при участии умеренного бактериофагов.

Различают три типа трансдукции:

-неспецифическая (общая) трансдукция;

-специфическая трансдукция;

-абортивная трансдукция.

При общей трансдукции фаг захватывает фрагмент бактериальной ДНК вместо своего генома. Специфическая трансдукция осуществляется фагами, геном которых при лизогенизации соединяется только с определенным участком хромосомы бактерий. Абортивная трансдукция - перенос фагом участка ДНК клетки-донора в клетку-реципиент, которая не включается в ее геном. При этом проявление нового признака не наблюдается.

2.3. Конъюгация (спаривание) - это передача генетического материала клетки-донора клетке-реципиенту при непосредственном контакте с помощью плазмид. Способность бактериальной клетки конъюгировать связана с наличием в ней полового F-фактора. Конъюгирующие клетки соединяются через конъюгационный мостик, образованный половой ворсинкой донорской клетки. Перенос генетического материала происходит в одном направлении - от донорской (мужской) F+-клетки к реципиентной (женской) F--клетке. Среди популяции клетокдоноров есть бактерии, которые могут при конъюгации передавать и фрагменты бактериальной хромосомы. Эти штаммы получили название RTF - бактерии с высокой частотой рекомбинации.

Плазмиды – внехромосомные молекулы ДНК, наделяющие бактерии дополнительными полезными свойствами. Плазмиды могут встраиваться в хромосому бактерий (интегративные плазмиды) или находиться в виде отдельной структуры в цитоплазме (автономные плазмиды).

После обсуждения теоретических вопросов преподаватель объясняет порядок проведения самостоятельной работы.

Самостоятельная работа:

7

1.Определение чувствительности бактерий к бактериофагу. Для этого на чашку Петри с МПА петлей наносится капля культуры стафилококка, равномерно распределяется шпателем по поверхности агара, и в центр чашки пипеткой

наносится капля суспензии стафилококкового бактериофага. Чашки инкубируют при температуре 36ОС в течение 24 часов.

2.Изучение демонстрационных чашек Петри, показывающих действие бактериофагов на бактериальную культуру. Результаты опыта студенты зарисовывают в рабочую тетрадь.

7.Оценивание знаний, умений, навыков по теме занятия:

Ответы на вопросы и активность на занятии оцениваются по 5-балльной системе.

8. Литература для подготовки:

8.1.Основная:

1.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Под ред. А.А. Воробьева. Учебники и учеб. пособия для высшей школы. Издательство: Медицинское информационное агентство, 2012. – 702 с.

2.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 1 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 448 с.: ил.

3.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 2 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 480 с.: ил.

8.2.Дополнительная:

1.Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для студентов мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - 5-е изд., испр. и

доп. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 759 с.: ил.

2.Медицинская микробиология: учебник. 4-е изд. Поздеев О.К. / Под ред. В.И. Покровского. – 2010. – 768 с.

3.Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга 1 / Колл. авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Волиной Е.Г. – М.: Издательство БИНОМ, 2008. – 1080 с.: ил.

Методические указания переработаны и дополнены профессором Литусовым Н.В.

Обсуждены на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.

ГБОУ ВПО “Уральский государственный медицинский университет” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Методические указания №7 к практическим занятиям для студентов

ООП специальности 060101.65 Лечебное дело Дисциплина С2.Б.10 Микробиология, вирусология

1.Тема: Микробиологические основы химиотерапии инфекционных

заболеваний. Сульфаниламиды. Антибиотики. Механизм действия. Побочное действие антибактериальных препаратов на организм. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

2.Цели занятия: Изучить со студентами основы химиотерапии инфекционных заболеваний, классификацию антибактериальных препаратов, механизмы действия антибактериальных препаратов на бактерии, методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

3.Задачи занятия:

3.1.Изучение классификации антибактериальных препаратов.

3.2.Изучение механизмов действия антибактериальных препаратов на микробную клетку.

3.3.Изучение методов определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

3.4.Выполнение самостоятельной работы.