merged(1)

ГБОУ ВПО “Уральский государственный медицинский университет” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Методические указания №4 к практическим занятиям для студентов

ООП специальности 060101.65 Лечебное дело Дисциплина С2.Б.10 Микробиология, вирусология

1.Тема: Характер роста микробов в жидких и на плотных питательных средах. Выделение чистой культуры бактерий.

2.Цели занятия: Изучить со студентами характер роста бактерий в жидких и на плотных питательных средах. Ознакомить студентов с основными характеристиками колоний микробов. Обучить студентов технике пересева для выделения чистой культуры бактерий.

3.Задачи занятия:

3.1.Изучение характера роста бактерий в жидких и на плотных питательных средах.

3.2.Ознакомление с основными характеристиками колоний бактерий.

3.3.Изучение пигментов бактерий.

3.4.Выполнение самостоятельной работы.

3

-ровные края в виде четко выраженной линии;

-неровные края (фестончатый, волнистый, эрозированный или зазубренный, бахромчатый).

4. Рельеф колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и формой на вертикальном разрезе. Определяется невооруженным глазом или при помощи лупы при рассматривании сверху и сбоку:

-каплеобразные и куполообразные колонии правильной круглой формы;

-плоско-выпуклые колонии;

-конусообразные колонии;

-колонии с приподнятой серединой;

-колонии с вдавленным центром;

-плоские колонии.

5.Поверхность колонии изучают при помощи лупы или под микроскопом при малом увеличении:

- матовая или блестящая с глянцем; - сухая или влажная; - гладкая или шероховатая.

Гладкие колонии обозначают буквой S (smooth - гладкий), шероховатые - буквой R (rough - шероховатый).

6.Цвет колонии. Определяется пигментом, который продуцирует культура микробов. Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образует (колонии бесцветны или молочно-мутного цвета). Пигментообразующие виды дают колонии кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные и др.

7.Структура колоний. Определяется в проходящем свете при слабом увеличении микроскопа, суженной диафрагме или при несколько опущенном конденсоре:

- гиалиновые колонии; - зернистые колонии;

- нитевидные или волокнистые колонии.

8.Консистенция колоний. Исследуют прикосновением или взятием из нее части материала бактериологической петлей:

- пастообразные, вязкие или слизистые; - волокнистые или кожистые; - хрупкие сухие.

Характер роста бактерий на жидких питательных средах:

1.Рост бактерий с равномерным помутнением среды.

2.Придонный рост бактерий (образование осадка на дне).

3.Пристеночный рост бактерий (образование рыхлых хлопьев,

прикрепленных к внутренней поверхности стенок сосуда).

4.Поверхностный рост бактерий (образование пленки на поверхности жидкой питательной среды).

Рост на полужидкой питательной среде характеризуется помутнением всей толщи среды или образованием сосульки цилиндрической или конической формы.

Пигментообразование у бактерий.

4

Образование пигментов происходит в присутствии кислорода, при пониженном освещении и температуре 20-25ОС. Пигменты классифицируют по цвету, химическому составу (каротиноиды, пирролы, азахиноны, феназины и др.), растворимости, по способности диффундировать в окружающую среду. Пигменты класса каротиноидов имеют белый, желтый, оранжевый, красный, бежевый цвет. Они обнаружены у стафилококков, сарцин, микрококков, микобактерий, коринебактерий, пурпурных бактерий, дрожжей. Пигмент феназинового класса синего цвета - пиоцианин присутствует у синегнойной бактерии. Пирролловый пигмент красного цвета - продигиозин выявлен у серратий (S. marcescens). К азахинонам принадлежит индигоидин - синий пигмент, выделяемый коринебактериями, псевдомонами, артробактерами и др. Производным индола является пигмент виоласеин, придающий сине-фиолетовую окраску колониям хромобактера. Бактериохлорофиллы встречаются у зеленых, красных несерных бактерий и др. К классу пиразиновых пигментов относится пулъхерримин, окрашивающий колонии грибов рода кандида в темно-красный цвет. Грибы обычно активно продуцируют пигменты широкой цветовой гаммы. Цвет пигмента зависит от состава питательной среды и условий культивирования. Важными элементами для образования пигментов являются азот, магний, железо, некоторые аминокислоты.

Пигменты подразделяют на растворимые в воде или в жирорастворителях (спирте, ацетоне, эфире) и нерастворимые в воде и спирте. Водорастворимые (феназиновые, пиразиновые) способны диффундировать в окружающую среду и окрашивают не только колонии микроорганизмов, но и питательные среды. Спирторастворимые (каротиноиды) и нерастворимые (птерины, меланины) тесно связаны с клеткой (хромофорные) и окрашивают только колонии микроорганизмов.

Выделение чистой культуры бактерий.

Чистая культура – культура микроорганизмов одного вида (потомство одной клетки). Методы выделения чистой культуры:

1.Метод Дригалъского – последовательный пересев культуры шпателем в 3 чашки Петри с агаром.

2.Метод параллельных штрихов – посев культуры штрихами по поверхности агара.

3.Метод Коха (метод рассева в глубине среды) – последовательный перенос капли культуры в расплавленном агаре из одной пробирки в другую, затем

–в третью и культивирование в чашках Петри (в толще агара).

После обсуждения теоретических вопросов преподаватель объясняет правила выполнения самостоятельной работы

Самостоятельная работа:

1.Описание бактериальных колоний, выросших на демонстрационных чашках Петри.

2.Описание характера роста бактерий в жидких питательных средах.

3.Провести пересев бактерий из изолированных колоний на плотные питательные среды с целью выделения чистой культуры.

7.Оценивание знаний, умений, навыков по теме занятия:

5

Ответы на вопросы и активность на занятии оцениваются по 5-балльной системе.

8. Литература для подготовки:

8.1.Основная:

1.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Под ред. А.А. Воробьева. Учебники и учеб. пособия для высшей школы. Издательство: Медицинское информационное агентство, 2012. – 702 с.

2.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 1 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 448 с.: ил.

3.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 2 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 480 с.: ил.

8.2.Дополнительная:

1.Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для студентов мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - 5-е изд., испр. и

доп. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 759 с.: ил.

2.Медицинская микробиология: учебник. 4-е изд. Поздеев О.К. / Под ред. В.И. Покровского. – 2010. – 768 с.

3.Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга 1 / Колл. авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Волиной Е.Г. – М.: Издательство БИНОМ, 2008. – 1080 с.: ил.

Методические указания переработаны и дополнены профессором Литусовым Н.В.

Обсуждены на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.

ГБОУ ВПО “Уральский государственный медицинский университет” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Методические указания №5 к практическим занятиям для студентов

ООП специальности 060101.65 Лечебное дело Дисциплина С2.Б.10 Микробиология, вирусология

1.Тема: Ферменты бактерий. Изучение ферментативной активности

микроорганизмов. Дыхание бактерий. Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

2.Цели занятия: Изучить со студентами ферменты бактерий, методы изучения ферментативной активности бактерий, дыхание бактерий, методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

3.Задачи занятия:

3.1.Изучение ферментов бактерий.

3.2.Ознакомление с методами изучения ферментативной активности бактерий.

3.3.Изучение дыхания бактерий.

3.4.Изучение методов культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

3.5.Выполнение самостоятельной работы.

2

4.Продолжительность занятия в академических часах: 3 часа.

5.Контрольные вопросы по теме:

5.1.Ферменты бактерий и методы определения ферментативной активности микробов.

5.2.Дыхание бактерий. Аэробные и анаэробные бактерии.

5.3.Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

6. Задания и методические указания к их выполнению.

На занятии студенту необходимо выполнить:

6.1.Ответить на вопросы преподавателя.

6.2.Принять участие в обсуждении изучаемых вопросов.

6.3.Изучить ферменты бактерий и методы определения ферментативной активности.

6.4.Познакомиться с методами культивирования и выделения чистых культур анаэробных бактерий.

6.5.Выполнить самостоятельную работу.

Теоретическая справка.

Ферменты бактерий представляют собой либо только белок с высокой молекулярной массой, либо состоят из белка (апофермента), связанного с кофактором (коферментом). Кофермент может быть низкомолекулярным неорганическим (металл) или органическим веществом.

Все ферменты делятся на шесть классов:

1.Оксидоредуктазы - катализируют окислительно-восстановительные реакции: дегидрогеназы (НАД, НАДФ, ФАД), каталаза, цитохромы.

2.Трансферазы - переносят группы атомов между молекулами от одних соединений к другим: ацетилтрансфераза, фосфотрансфераза, аминотрансфераза.

3

3.Гидролазы - переносят функциональные группы с участием воды, расщепляют различные соединения: пептидгидролазы, глюкозидаза, амилазы, эстеразы, липаза, фосфатаза.

4.Лиазы – отщепляют от субстрата химические группы: пируватдекарбоксилаза, альдолаза.

5.Изомеразы – переносят группы внутри молекул с образованием изомерных форм: триизофосфатизомераза, глюкозофосфатизомераза.

6.Лигазы (синтетазы) – объединяют две молекулы с одновременным разрывом фосфатных связей с использованием энергии АТФ: аспарагинсинтетаза, кокарбоксилазы.

Активность ферментов измеряют в международных единицах (ME). 1 ME соответствует количеству ферментов, превращающему один микромоль субстрата в 1 минуту в стандартных условиях.

Эндоферменты находятся внутри бактериальной клетки, катализируют внутриклеточные процессы обмена веществ.

Экзоферменты выделяются во внешнюю среду и выполняют функцию расщепления сложных питательных веществ.

Некоторые экзоферменты являются ферментами агрессии, так как они способствуют проникновению и распространению бактерий в тканях организма хозяина и ослаблению его защитных свойств. К ферментам агрессии относятся: гиалуронидаза, нейраминидаза, коллагеназа, протеазы, фибринолизин, гемолизин, лейкоцидин.

Конститутивные ферменты – это ферменты, которые синтезируются клеткой с постоянной скоростью, независимо от наличия субстрата в среде. Индуцибельные (адаптивные) ферменты образуются только в присутствии соответствующего субстрата в среде (бета-галактозидаза синтезируется только при добавлении в питательную среду лактозы).

Методы определения ферментативной активности микробов. При идентификации выделенной чистой культуры бактерий определяют ферментативную активность по следующим свойствам:

-сахаролитическая активность;

-протеолитическая активность;

-липолитическая активность;

-каталазная активность;

-ферменты патогенности.

Ферменты, разлагающие углеводы (сахаролитические ферменты)

определяют на дифференциально-диагностических средах Гисса. В состав сред Гисса входит 1% пептонная вода, индикатор, поплавок для улавливания газа и 0,5% одного из углеводов (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза, крахмал и т.д.). При ферментации углевода до кислоты меняется только цвет среды. При ферментации углевода до кислоты и газа меняется цвет среды и в поплавке накапливаются пузырьки газа. В качестве индикаторов используют индикатор Андреде (кислый фуксин в растворе едкого натра), индикатор ВР (смесь водного голубой и розоловой кислоты), бромтимоловый синий и др. Среды с реактивом Андреде при ферментации углеводов меняют окраску на красный цвет. Среды с индикатором ВР в кислой среде становятся синими, а в щелочной среде – красными.

4

Протеолитическая активность бактерий оценивается по расщеплению белка с образованием индола (расщепление триптофана), аммиака (разложение фенилаланина), сероводорода (разложение серосодержащих аминокислот – цистина, цистеина, метионина). Для выявления этих газообразных веществ делают посевы чистой культуры бактерий в мясо-пептонный бульон или пептонную воду в пробирки, под пробку которых помещают полоски бумаги, пропитанные индикаторами. При наличии продуктов расщепления меняется цвет соответствующего индикатора.

Индол: индикатор - щавелевая кислота; первоначально белая бумага окрашивается в розовый цвет.

Аммиак: индикатор – лакмус; первоначально розовая бумага окрашивается в синий цвет.

Сероводород; индикатор – ацетат свинца; первоначально белая бумага окрашивается в черный цвет (образование сульфата свинца).

Протеолитическую активность бактерий можно определить путем посева чистой культуры уколом в столбик 10-20% желатина по наличию и характеру разжижения среды (в виде перевернутой елочки, гвоздя, воронки, наполненной разжиженным желатином).

Протеолитическую активность бактерий можно определить путем посева чистой культуры в столбик свернутой сыворотки по ее разжижению.

Протеолитическую активность бактерий можно определить путем посева чистой культуры на молочный агар Эйкмана по образованию зон просветления (протеолиза) вокруг колоний.

Определение каталазы проводят следующим образом: на предметное стекло наносят исследуемую культуру и добавляют каплю 3% раствора перекиси водорода. Выделение пузырьков кислорода указывает на наличие у микроба каталазы.

Определение ДНКазы проводят на агаре, содержащем ДНК в конечной концентрации и хлорид кальция. После выращивания наносят раствор соляной кислоты. При положительной реакции вокруг колоний на мутном фоне образуется прозрачная зона деполимеризованной ДНК.

Определение гемолизина проводят на кровяном агаре:

-альфа-гемолиз – зеленовато-коричневый ореол вокруг колоний (гемоглобин разрушен до метгемоглобина);

-бета-гемолиз – прозрачная зона гемолиза вокруг колоний (гемоглобин разрушен полностью);

-гамма-гемолиз – видимая зона гемолиза отсутствует.

Определение плазмокоагулазы и фибринолизина проводят путем внесения культуры в плазму крови животных (кроликов). При наличии коагулазы через 0,5-4 часа в плазме образуется плотный сгусток. При наличии фибринолитической активности через 20 часов сгусток растворяется.

Определение лецитиназы проводят на агаре, содержащем яичный желток (среда Чистовича). При положительной реакции вокруг колоний возникает зона опалесценции с радужным венчиком.

5

Определение липазы проводят на агаре, содержащем яичный желток или 5% кукурузного масла. При положительном результате при косом освещении наблюдают перламутровый блестящий слой.

На разной ферментативной активности бактерий основаны многие дифференциально-диагностические среды, например, среды Эндо, Левина и Плоскирева, используемые при диагностике кишечных инфекций.

Среда Эндо состоит из МПА, лактозы и индикатора (фуксин с сульфитом натрия - фуксин-сернистая кислота). Среда бледно-розового цвета. Микробы, имеющие фермент лактазу, ферментируют лактозу с образованием альдегидов, и фуксин-сернистая кислота переходит в альдегид-сернистое соединение. Фуксин восстанавливается, окрашивая колонии в красный цвет с металлическим блеском. Лактозоотрицательные бактерии образуют бесцветные (серовато-белые) колонии.

Среда Левина состоит из МПА, лактозы и индикатора (метиленовый синий, эозин, и калия гидроортофосфат). Эта среда красно-фиолетового цвета. Лактозоположительные бактерии образуют колонии темно-синего цвета с зеленым блеском, лактозоотрицательные - бесцветные (серовато-белые) колонии.

Агар Плоскирева состоит из МПА, лактозы и индикатора (бриллиантовый зеленый, соли желчных кислот, йод, нейтральный красный). Среда коричневатокрасного цвета. Эта среда является не только дифференциально-диагностической, но и элективной, так как она подавляет рост многих микроорганизмов и способствует лучшему росту возбудителей брюшного тифа, паратифов и дизентерии. Лактозоотрицательные бактерии образуют бесцветные (серовато-белые) колонии, а лактозоположительные – колонии красного (брусничного) цвета.

Энергетический метаболизм.

Метаболизм - это совокупность биохимических реакций, результатом которых является образование (накопление энергии) и расщепление (расход энергии) макроэргических связей в молекулах АТФ. У бактерий АТФ может синтезироваться в результате процессов брожения и дыхания.

Брожение - способ получения энергии, при котором в результате расщепления молекулы глюкозы образуется 2 молекулы АТФ. Конечными продуктами брожения являются СО2, вода, спирты и органические кислоты. Процесс происходит без участия кислорода.

Дыхание - процесс окислительного фосфорилирования углеводов с образованием молекул АТФ, СО2 и воды. При распаде одной молекулы глюкозы высвобождаются 12 электронов, которые проходят через цепь дыхательных ферментов, отдавая энергию для синтеза 36 молекул АТФ. Освобождение дыхательной цепи от электронов осуществляют вещества, называемые акцепторами электронов. К таким веществам относится кислород, сульфаты, нитраты, карбонаты. Если конечным акцептором электронов служит молекулярный кислород, дыхание называют аэробным. В случае конечной акцепции электронов другими соединениями дыхание называют анаэробным.

По типу дыхания бактерии классифицируют на четыре основные группы:

1.Облигатные (строгие) аэробы растут при свободном доступе кислорода (возбудитель туберкулеза).

2.Микроаэрофилы растут при низкой (до 1%) концентрации кислорода и повышенной концентрации углекислого газа (гемофильная палочка).