merged(1)

3

I. Действие физических и химических факторов на микроорганизмы.

Выделяют физические, химические и биологические факторы внешней среды, влияющие на микроорганизмы.

Физические факторы. Из физических факторов наибольшее влияние на микроорганизмы оказывают температура, влажность, излучение.

Температура. По отношению к температурным условиям микроорганизмы разделяют на мезофильные, психрофильные и термофильные. Для мезофилов оптимальная температура роста составляет 20-40°С. Область температур роста психрофилов лежит в пределах от 0 до 20°С. Термофильные бактерии растут при температурах от 40 до 98°С.

Влажность. Важнейшим фактором поддержания жизнеспособности микробной клетки является вода, поскольку именно в растворах протекают все биологические процессы. Вода находится в клетке в свободном или связанном состоянии.

Действие излучения. Солнечный свет может обеспечивать выраженный антимикробный эффект. Ультрафиолетовое излучение вызывает замедление роста культур, снижает скорость деления клеток, способствует развитию мутаций. УФлучи широко применяются для обеззараживания воздуха в помещениях, воды, отходов производства.

Ионизирующее излучение вызывает повреждения ДНК. Ионизирующее излучение используется для стерилизации биопрепаратов, перевязочного материала, инструментов.

Действие лазера вызывает у микроорганизмов в зависимости от дозы облучения изменения морфологических и биохимических свойств, вплоть до утраты жизнеспособности. При этом происходит денатурация белка и повреждение нуклеиновых кислот.

Влияние химических факторов на микроорганизмы. Концентрация ионов водорода. Оптимальное значение рН для роста различных микроорганизмов составляет 1,0-11,0. Для подавляющего большинства прокариотов оптимальной является среда, близкая к нейтральной. Такие организмы называют нейтрофильными. У некоторых видов бактерий оптимум рН для роста находится в кислой (рН 4,0 и ниже) или щелочной (рН от 9,0 и выше) области. Такие бактерии называются ацидофильными (кислотолюбивыми) и алкалофильными

(щелочелюбивыми). К кислотоустойчивым относятся многие грибы, микобактерии (туберкулезная палочка). Устойчивыми к рН 9,0-10,0 являются многие из кишечных бактерий.

Соединения и ионы, токсичные для бактерий. Действие токсичных для бактерий соединений может быть бактериостатическим или бактерицидным.

Бактериостаз – это задержка роста и размножения бактерий, вызванная действием неблагоприятных химических или физических факторов. Прекращение действия фактора приводит к возобновлению роста и деления. Бактерицидные факторы вызывают гибель клеток. Во многих случаях вещество в небольших концентрациях обладает бактериостатическим, а в высоких концентрациях - бактерицидным действием.

Стерилизация. Дезинфекция.

4

Стерилизация (обеспложивание) – это полное уничтожение микроорганизмов в объектах, подвергающихся обработке. Методы стерилизации подразделяются на физические и химические.

К физическим методам стерилизации относятся:

-тепловая стерилизация,

-лучевая стерилизация,

-стерилизация ультразвуком,

-ультрафильтрация.

Тепловая стерилизация основана на использовании высоких температур: стерилизация в пламени (прожигание, фламбирование), сухожаровая стерилизация, стерилизация перегретым паром под давлением (автоклавирование).

Прожигание является простым и надежным методом, однако имеет ограниченное применение (для стерилизации бактериологических петель).

Стерилизацию сухим жаром осуществляют в воздушных стерилизаторах (прежнее название – сухожаровые шкафы или печи Пастера). Этим методом стерилизуют лабораторную посуду и другие изделия из стекла, металлические инструменты, то есть объекты, которые не теряют своих качеств при высокой температуре. Режимы стерилизации: 160°С в течение 120 минут, 180°С - 40 минут.

Стерилизация паром под давлением (автоклавирование) - наиболее универсальный метод стерилизации. Проводится в автоклаве, представляющем собой герметически закрывающуюся емкость, в которую поступает перегретый пар. Температура пара при 0,5 атмосферы составляет 111°С; при 1 атмосфере – 121°С, при 2 атмосферах – 132 °С. Наиболее часто используемый режим стерилизации в автоклаве 121°С в течение 40 минут. В автоклаве стерилизуют перевязочный материал, белье, коррозионно-устойчивые металлические инструменты, питательные среды, растворы.

Одной из разновидностей тепловой стерилизации является дробная стерилизация при температурах от 56°С (тиндализация) до 100°С, применяемая для обработки материалов, не выдерживающих дальнейшее нагревание. В частности, данный метод может применяться для стерилизации питательных сред. Материал нагревают в течение 30-60 минут, а затем помещают на сутки в термостат при 37°С. Процедуру повторяют трижды. Нагревание стимулирует прорастание спор. Образовавшиеся вегетативные формы погибают при последующем повышении температуры

Лучевая стерилизация осуществляется в специальных установках с помощью гамма-излучения. Инактивация микроорганизмов под действием гаммалучей происходит в результате повреждения нуклеиновых кислот. Лучевая стерилизация позволяет обрабатывать сразу большое количество предметов (одноразовых шприцев, систем для переливания крови и т.д.).

Ультрафильтрация является широко используемым методом стерилизации растворов лекарственных препаратов. Жидкости пропускаются через мембранные фильтры с диаметром пор, через которые не проходят бактерии и вирусы.

Химическая стерилизация проводится с использованием газов: оксида этилена, смеси ОБ (смеси оксида этилена и бромистого метила в весовом соотношении 1:2,5) и паров формальдегида. Стерилизация газами осуществляется в присутствии пара при температуре от 18 до 80°С в специальных камерах.

5

Дезинфекция (обеззараживание) – это процедура, направленная на уничтожение патогенных микроорганизмов, предусматривающая обработку объектов внешней среды, помещений, одежды, белья, инструментария.

Различают три основных метода дезинфекции:

-тепловая дезинфекция;

-УФ-облучение;

-химическая дезинфекция.

Тепловая дезинфекция. Температура 100°С в течение 5 минут убивает все вегетативные формы бактерий и большинство вирусов. При добавлении в воду 2% натрия гидрокарбоната погибают и споры.

Разновидностью тепловой дезинфекции является пастеризация – прогревание при температуре ниже 100ОС. При используемом обычно режиме (6070°С в течение 20-30 минут) погибает большинство вегетативных форм бактерий, но сохраняются споры.

Ультрафиолетовое облучение (лучи с длиной волны 200-400 нм)

производится с помощью специальных бактерицидных ламп (настенных, потолочных, передвижных и др.) для обеззараживания воздуха, и поверхностей в помещениях (операционных, перевязочных, микробиологических лабораториях), Действие ультрафиолетовых лучей приводит к разрушению ДНК микробов в результате образования тиминовых димеров.

Химическая дезинфекция проводится с помощью различных дезинфицирующих веществ.

Асептика и антисептика. Асептикой называется комплекс мероприятий,

направленных на предотвращение попадания патогенных микроорганизмов в стерильную зону (операционная рана, питательная среда и т.д.).

Антисептикой называется комплекс мероприятий, направленных на снижение концентрации микроорганизмов на поверхности или в глубине тканей организма (кожные покровы, операционная рана).

Основные группы дезинфицирующих и антисептических веществ, механизм их антибактериального действия.

1.Спирты, или алкоголи (этанол, изопропанол и др.) наиболее эффективны в виде 60-70%-ных водных растворов. Спирты денатурируют белки и растворяют липиды. Эффективны в отношении вегетативных форм большинства бактерий, однако споры бактерий и грибов, а также некоторые вирусы к ним устойчивы.

2.Галогены и галогенсодержащие препараты (препараты йода и хлора)

взаимодействуют с гидроксильными группами белков, нарушая их структуру. В качестве антисептиков для обработки операционного поля применяют спиртовый раствор йода, йодинол. Хлорсодержащие препараты широко применяют для обеззараживания воды. Взаимодействуя с водой, хлор образует хлорноватистую кислоту, которая является сильным окислителем. К хлорсодержащим средствам, используемым для дезинфекции относятся хлорная известь, хлорамин Б, хлоргексидина биглюконат (гибитан).

3.Альдегиды алкилируют сульфгидрильные, карбоксильные и аминогруппы белков и других органических соединений, вызывая гибель микроорганизмов. Альдегиды широко применяют как консерванты. Наиболее известные из них (8% формальдегид, 2-2,5% глутаральдегид) проявляют раздражающее действие

6

(особенно пары), поэтому имеют ограниченное применение. Растворы формальдегида обладают дезинфицирующим и дезодорирующим эффектами. Их применяют для дезинфекции инструментов. Мыльный раствор формальдегида (лизоформ) применяют для спринцеваний в гинекологической практике, для дезинфекции рук и помещений.

Уротропин (гексаметилентетрамин) в кислой среде организма расщепляется с выделением формальдегида; последний, выделяясь с мочой, оказывает антисептическое действие. Применяют при инфекционных процессах мочевыводящих и желчевыводящих путей, кожных заболеваниях. Входит в состав комбинированных препаратов (кальцекс, уробесал).

4.Кислоты и щёлочи применяют как антисептики. Среди кислот наиболее известны борная, бензойная, уксусная и салициловая кислоты. Их применяют для лечения поражений, вызванных патогенными грибами и бактериями. Наиболее распространена салициловая кислота, используемая в спиртовых растворах (1-2%), присыпках, мазях, пастах; она оказывает также раздражающее и кератолитическое действие. Из щелочей наиболее распространён раствор аммиака (нашатырный спирт содержит 9,5-10,5% аммиака), применяемый для обработки рук в хирургической практике (0,5% раствор нашатырного спирта).

Органические кислоты (бензойная, салициловая, молочная, аскорбиновая, пропионовая) широко применяются в качестве консервантов в пищевой и фармацевтической промышленности.

5.Соли тяжелых металлов связываются с белками и другими органическими соединениями. В качестве антисептиков применяют нитрат серебра (ляпис), сульфат меди (медный купорос) и хромат ртути.

6.Фенолы и их замещенные производные денатурируют белки,

повреждают клеточные мембраны и нарушают структуру клеточной стенки бактерий (гексахлорофен, резорцин, хлорофен, тимол, салол).

7.Поверхностно-активные вещества включают анионные (мыла) и

катионные детергенты. Мыла обеспечивают механическое удаление микроорганизмов с поверхностей кожи и объектов внешней среды. Из катионных детергентов наиболее широко используются четвертично-аммониевые соединения (ЧАС), обладающие антимикробной активностью - они взаимодействуют с фосфолипидами мембран, нарушая их функции. Применяют для дезинфекции и антисептики.

8.Газы. Для уничтожения спор микроорганизмов при стерилизации предметов из пластмасс применяют окиси этилена и пропилена под давлением при 30-60°С. Механизм действия связан со способностью окиси этилена алкилировать белки. В частности, повреждению подвергаются сульфгидрильные группы вегетативных форм бактерий и карбоксильные группы оболочек спор.

9.Красители. В качестве антисептиков применяют различные красители (например, бриллиантовый зелёный, метиленовый синий, риванол, основный фуксин). Бриллиантовый зеленый и некоторые другие красители взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами, нарушая их функции.

10.Окислители. Механизм антимикробной активности связан с окислением метаболитов и ферментов микроорганизмов, либо денатурацией микробных белков.

7

Наиболее распространёнными окислителями, применяемыми как антисептики, являются перекись водорода и перманганат калия.

II. Физиология бактерий – это раздел микробиологии, изучающий химический состав, питание, дыхание, рост и размножение бактерий.

Химический состав бактерий. 70% от общей массы бактериальной клетки составляет вода. Часть воды находится в свободном состоянии, а часть - в связанном. В состав бактериальных клеток входят макроэлементы (азот, углерод, кислород и водород), микроэлементы (калий, кальций, магний, натрий, сера, фосфор, хлор) и ультрамикроэлементы (бор, ванадий, железо, кобальт, медь, цинк).

Азотсодержащие вещества представлены белками. Белки составляют 5080% сухого вещества бактериальных клеток. Функции белков разнообразны: структурная, каталитическая, двигательная, транспортная, защитная.

Нуклеиновые кислоты представляют собой высокомолекулярные биологические полимеры, построенные из мононуклеотидов. Содержание нуклеиновых кислот в бактериальной клетке может быть от 10 до 30% сухого вещества. Нуклеиновые кислоты бактерий представлены РНК (рибонуклеиновая кислота) и ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота). РНК в основном содержится в рибосомах, ДНК - в нуклеоиде. ДНК является носителем наследственной информации бактерий.

Липиды - истинные жиры, липоиды - жироподобные вещества. Риккетсии, дрожжи, микобактерии и грибы содержат до 40% липидов. У других групп бактерий содержание липидов составляет 3-7%. С липидами связана кислотоустойчивость некоторых бактерий, в частности, микобактерий.

Содержание углеводов составляет 12-18% сухого вещества. Они выполняют энергетическую роль в бактериальной клетке.

Питание бактерий.

1.Углеродное питание. По источнику получения углерода микроорганизмы подразделяются на две группы:

- автотрофы (аутотрофы) - микроорганизмы, способные усваивать углерод из неорганических соединений - углекислоты воздуха или карбонатов. Автотрофы из простых соединений синтезируют белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, витамины и другие структурные и функциональные молекулы.

- гетеротрофы - микроорганизмы, использующие углерод только из готовых органических соединений - вызывают процессы брожения, гниения, а также заболевания человека и животных. Гетеротрофы подразделяются на две подгруппы: сапрофиты (получают углерод из останков организмов или продуктов) и паразиты (живут на поверхности или внутри организма хозяина и питаются за его счет).

2.Азотное питание микроорганизмов. По способу усвоения азота бактерии подразделяются на 4 группы:

1.Протеолитические - способные расщеплять белки и пептиды;

2.Дезаминирующие - способные отщеплять аминогруппы только у свободных аминокислот;

3.Нитритно-нитратные - усваивающие окисленные формы азота;

4.Азотфиксирующие - обладающие свойством усваивать атмосферный азот.

8

3.Потребность в минеральных веществах. Серу бактерии получают из сульфатов или из некоторых аминокислот (цистин, цистеин). Фосфор входит в состав фосфорнокислых солей. Калий, магний и железо микроорганизмы также получают из различных солей. В бактериальной клетке сера входит в состав аминокислот (цистеин, метионин), витаминов и кофакторов (биотин, липоевая кислота и др.), а фосфор - необходимый компонент нуклеиновых кислот, фосфолипидов, коферментов.

4.Прототрофы и ауксотрофы. Гетеротрофные бактерии, способные расти на питательных средах, в состав которых входит одно органическое вещество в качестве источника углерода, а остальные химические элементы содержатся в составе неорганических соединений, называются прототрофами.

Бактерии, для роста и размножения которых требуются дополнительные органические вещества (факторы роста), называются ауксотрофами. К факторам роста относятся аминокислоты, витамины, пурины, пиримидины, пентозы, гексозы, липиды. Универсальным источником факторов роста является сыворотка крови животных, которую добавляют в питательные среды для культивирования ауксотрофов.

Транспорт питательных веществ в бактериальную клетку.

1.Пассивная диффузия (осмос) - поступление питательных веществ из окружающей среды через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану в результате разницы концентраций питательных веществ внутри бактериальной клетки и в питательной среде. Процесс осуществляется по направлению градиента концентрации вещества без затрат энергии АТФ. Посредством пассивной диффузии

вклетку поступает вода и некоторые ионы.

2.Облегченная диффузия. Осуществляется по направлению градиента концентрации с участием специальных белков-переносчиков, которые называются пермеазами. Пермеаза на внешней стороне цитоплазматической мембраны специфически связывается с молекулой субстрата. На внутренней поверхности мембраны происходит диссоциация комплекса пермеаза - субстрат. При этом транспортируемое вещество высвобождается в цитоплазму, а пермеаза вновь принимает первоначальное положение. Облегченная диффузия осуществляется без затрат энергии АТФ.

3.Активный транспорт. Осуществляется против градиента концентрации с помощью пермеаз и с затратой энергии АТФ. По этому механизму в бактериальные клетки поступает основное количество питательных веществ.

4.Перенос групп. Сущность этого механизма состоит в переносе питательного вещества внутрь клетки против градиента концентрации с помощью пермеаз в химически измененной форме с затратой энергии АТФ. По этому механизму внутрь клетки поступают крупные молекулы питательных веществ.

Питательные среды, их классификация.

Микроорганизмы культивируют на питательных средах. Питательные среды подразделяются на группы в зависимости от свойств.

По физическому состоянию питательные среды подразделяются на: - жидкие среды; - полужидкие среды;

- твердые (плотные) среды;

9

Жидкие среды представляют собой настои, отвары, бульоны, приготовленные на основе мяса, рыбы, овощей (естественные среды), а также композиции определенных концентраций химических соединений (искусственные среды). Полужидкие среды получают путем добавления к жидким средам 0,5-0,9% агар-агара (желеобразующее вещество, получаемое из морских водорослей). К плотным питательным средам относят среды, содержащие 2-3% агара.

По сложности питательные среды подразделяются на:

-простые, или обычные среды (пептонная вода, мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар);

-сложные, или специальные среды (кровяной агар, асцитический агар и бульон, мясо-пептонный сахарный бульон, сывороточный агар и бульон, свернутая сыворотка, кровяной бульон).

По происхождению питательные среды подразделяются на:

-естественные среды;

-полусинтетические среды;

-синтетические среды.

Естественные питательные среды - это природные органические среды непостоянного состава, которые включают продукты животного или растительного происхождения. К ним относятся пептоны, кровь, отвары и экстракты, полученные из природных субстратов (мясо, рыба, крупы).

Полусинтетические среды кроме органических и неорганических веществ известного состава содержат продукты природного происхождения (картофельная среда с глюкозой, дрожжевая среда).

Синтетические питательные среды состоят из определенных количеств органических и неорганических химических соединений известного состава.

По набору питательных веществ выделяют:

-минимальные среды, которые содержат лишь источники питания, достаточные для роста;

-богатые среды, в состав которых входят многие дополнительные

вещества.

В зависимости от назначения питательных сред различают:

-основные среды;

-элективные (селективные) среды;

-дифференциально-диагностические среды;

-накопительные среды (среды обогащения).

К основным средам относятся мясо-пептонный агар и мясо-пептонный бульон. На этих средах растет большинство бактерий.

Дифференциально-диагностические среды - это сложные среды,

позволяющие изучать биохимические свойства бактерий. Эти среды используются для определения вида бактерий.

Элективные (селективные) питательные среды содержат вещества,

подавляющие рост одних бактерий, и не влияющие на рост других бактерий. Эти среды служат для выделения определенного вида бактерий из смешанных популяций.

Накопительные питательные среды (среды обогащения) - это среды, на которых определенные виды культур растут быстрее и интенсивнее сопутствующих.

10

III. Бактериологический метод исследования.

Целью бактериологического исследования является выделение чистой культуры возбудителя, его идентификация и определение чувствительности к антибактериальным препаратам.

Бактериологический метод исследования включает 4 этапа:

-посев исследуемого материала на питательные среды;

-выделение чистой культуры возбудителя;

-идентификация возбудителя (определение вида бактерий) и определение чувствительности к антибактериальным препаратам;

-учет результатов и выдача заключения.

Первый этап. Техника посева материала на питательные среды.

Материалами для бактериологического исследования служат: кровь, моча, отделяемое раны, мокрота, фекалии, рвотные массы, смывы с кожи и слизистых оболочек и др. Поступивший в лабораторию материал подвергают бактериологическому исследованию в тот же день.

На первом этапе исследуемый материал высевают в жидкую питательную среду (для накопления возбудителя и определения характера его роста) и на плотную питательную среду (для выделения чистой культуры возбудителя).

Техника посева зависит от характера исследуемого материала и консистенции питательной среды.

Жидкий материал для посева берут бактериологической петлей или стерильной пипеткой. Все манипуляции проводят вблизи пламени горелки. Бактериологическую петлю перед взятием материала и по окончании посева стерилизуют прокаливанием в пламени горелки. Пипетки после посева погружают в дезраствор.

При посеве в жидкую питательную среду петлю с материалом погружают в среду и легким покачиванием смывают материал. Пипетку погружают в среду и материал сливают.

При посеве на скошенный питательный агар в пробирке петлю с материалом вносят вблизи пламени горелки в пробирку и материал штрихом распределяют по поверхности агара.

Посев материала на агар в чашке Петри проводят с помощью бактериологической петли, шпателя или тампона. Посев бактериологической петлей проводят штрихом по поверхности агара. С помощью шпателя или тампона исследуемый материал распределяется по поверхности среды круговыми движениями.

Для посева в толщу питательной среды материал вносят в стерильную чашку Петри или в пробирку, добавляют остуженный (40-45ОС) расплавленный агар и перемешивают.

Посев уколом в столбик питательной среды проводят с помощью бактериологической иглы или петли путем прокалывания столбика среды.

После обсуждения теоретических вопросов преподаватель объясняет порядок и технику выполнения самостоятельной работы.

Самостоятельная работа.

11

Каждый студент проводит пересев бактерий из жидких и с агаровых культур на плотные и в жидкие питательные среды. Порядок пересевов студенты записывают в рабочую тетрадь.

7. Оценивание знаний, умений, навыков по теме занятия:

Ответы на вопросы и активность на занятии оцениваются по 5-балльной системе.

8. Литература для подготовки:

8.1.Основная:

1.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Под ред. А.А. Воробьева. Учебники и учеб. пособия для высшей школы. Издательство: Медицинское информационное агентство, 2012. – 702 с.

2.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 1 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 448 с.: ил.

3.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 2 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 480 с.: ил.

8.2.Дополнительная:

1.Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для студентов мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - 5-е изд., испр. и

доп. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 759 с.: ил.

2.Медицинская микробиология: учебник. 4-е изд. Поздеев О.К. / Под ред. В.И. Покровского. – 2010. – 768 с.

3.Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга 1 / Колл. авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Волиной Е.Г. – М.: Издательство БИНОМ, 2008. – 1080 с.: ил.

Методические указания переработаны и дополнены профессором Литусовым Н.В.

Обсуждены на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.