4.3. Пируват – дегидрогеназный комплекс – организованная система ферментов

Обратимся теперь к механизму некоторых реакций. Окислительное декарбоксилирование пирувата с образованием ацетил – СоА катализируется Пируват – дегидрогеназным комплексом, организованной системой трех видов ферментов. Превращения, катализируемые этим комплексом, описываются следующем суммарным уравнением:

Пируват + СоА + NAD⁺ Ацетил – СоА + CO + NADH.

Механизм этой реакции гораздо, сложнее чем можно было бы думать, исходя только из стехиометрии. Помимо стехиометрических кофакторов СоА и NAD⁺ в ней в качестве каталитических кофакторов участвуют тиаминпирофосфат (ТПФ), лиапомид и FAD.

Превращение пирувата в ацетил – СоА происходит в четыре стадии. На первой стадии пируват соединяется с ТПФ и затем подвергается декарбоксилированию. Реакция катализируется пируват – дегидрогеназным комплексом мультиферментного комплекса.

Пируват + ТПФ Гидроксиэтил – ТПФ + CO .

Решающее значение для данного процесса имеет следующая особенность ТПФ, простетической группы пируват – дегидрогеназного компонента: очень кислый характер углерода, находящегося между атомами азота и серы тиазолового кольца. Он ионизируется, образуя карбанион, который легко присоединяется к карбонильной группе пирувата.

Положительно заряженный азот в кольце ТПФ принимает на себя электроны, стабилизируя формирование отрицательного заряда, необходимого для декарбоксилирования.

Затем протонирование приводит к образованию гидроксиэтиламинпирофосфата.

На второй стадии гидроксиэтильная группа, связанная с ТПФ, окисляется с образованием ацетильной группы и одновременно переносится на липоамид. Окислителем в этой реакции служит дисульфидная группа липоамида, которая превращается в сульфгидрильную группу. Реакция катализируется дигидролипоилтрансацетилазным компонентом комплекса и приводит к образованию ацетиллипоамида.

На третьей стадии ацетильная группа переносится с ацелиллипоамидом на СоА, образуя ацетил – СоА. Процесс также катализируется дигидролипоил – трансацетилазой. При переходе ацетильной группы на СоА сохраняется богатая энергией тиоэфирная связь.

На четвертой, завершающей стадии, происходит регенерирование окисленной формы липоамида. Реакция катализируется дигидролипоил – дегидрогеназным компонентом комплекса. Окислителем в ней служит NAD⁺ , а роль простатической группы фермента выполняет FAD.

Источником сведений, проливших свет на структуру и сборку пируват – дегидрогеназного комплекса, явились иссле-дования Лестера Рида. Интенсивному изучению был подвергнут ферментный комплекс из Е. coli.

Было установлено, что его мол. масса 4600 кДа, и что он состоит из 48 полипептидных цепей. Ядро (сердцевину) пируват–дегидрогеназного комплекса составляют поли-пептидные цепи трансацетилазы. Пируват–дегидрогеназный и липоид–дегидрогеназный компоненты связываются с наружной стороны этого ядра, состоящей из трансацетилазных компонентов.

Составляющие комплекс полипептидной цепи удерживаются вместе нековалентными силами. При щелочных значениях рН комплекс диссоциирует на пируват– дегидрогеназный компонент и субкомплекс из двух других ферментов. Трансацетилазу можно затем отделить от дегидрогеназы при нейтральных значениях рН в присутствии мочевины. После смешивания при нейтральном значении рН в отсутствии мочевины происходит самопроизвольная ассоциация этих трех ферментов с образованием пируват– дегидрогеназного комплекса. Таким образом, нативный ферментный комплекс может, по–видимому, образовываться путем самосборки.

Структурное объединение трех видов ферментов делает возможным координированный катализ при осуществлении сложной реакции. Все промежуточные продукты реакции окислительного декарбоксилирования пирувата прочно связываются с комплексом. Тесная близость между ферментами увеличивает суммарную скорость процесса и сводит к минимуму побочные реакции. Активированные промежуточные продукты переносятся от одного активного центра к другому липоамидной простетической группой трансацетилазы. Присоединение липоильной группы к е – аминогруппе лизинового остатка трансацетилазы создает гибкий рычаг для реакционно–способного кольца. Этот молекулярный рычаг в 14 А способствует взаимодействию липоильной части трансацетилазной субъединицы и с флавиновым компонентом соседней липоид–дегидрогеназы. Кроме того, липоильные компоненты мультиферментного комплекса могут реагировать друг с другом, образуя сеть взаимодействующих реакционно-способных групп. Заряд липоильного компонента в течение цикла его превращений составляет 0, -1 или -2 при полной ионизации сульфгидрильных групп. Эти изменения заряда могут служить движущей силой для направленного движения липоильной группы.

Окислительное декарбоксилирование -оксоглутарата имеет много общего с соответствующим процессом для пирувата: -Оксоглутарат + СоА + NAD⁺ Сукцинит – СоА + + CO + NAD⁺ Ацетил – СоА + CO + NADН.

В обеих реакциях участвуют одни и те же кофакторы: ТПФ, липоамид, СоА, FAD и NAD⁺. По существу окислительное декарбоксилирование -оксоглутарата катализируется ферментным комплексом, сходным по структуре с пируват–дегидрогеназным комплексом. В состав -оксоглутарат–дегидрогеназного комплекса входят три вида ферментов: -оксоглутарат дегидрогеназный(А ),транссукцинилазный (В ) и дигидролипоил- дегидрогеназный (С ) компоненты. Далее, А связывается с В и В связывается с С , но А и С непосредственно не связываются. Таким образом, ядром комплекса составляет транссукцинилаза.

-оксоглутарат–дегидрогеназный комплекс (А ) и транссукцинилаза (В ) отличаются от соответствующих ферментов (А и В) пируватдегидрогеназного комплекса. В то же время дигидролипоил – дегидрогеназные части (С и С ) обоих комплексов идентичны. Опыты с реконструированием этих систем показали, что комплекс, образованный А, В и С , также активен в отношении окислительного декарбоксилирования пирувата, как комплекс А, В и С. Подобно этому С и С взаимозаменяемы при образовании реконструированного комплекса, осуществляющего окислительное декарбоксилирование -оксоглутарата.

Как ранее было отмечено, химотрипсин, трипсин, тромбин, эластаза являются гомологичными ферментами. Здесь мы видим, что пируват и -оксоглутарат– дегидрогеназные комплексы, которые представляют собой гомологичные ассоциации ферментов. Структурные и механические особенности, обеспечивающие координированный катализ на входе в цикл трикарбоновых кислот, вновь используются позднее в процессе функционирования этого цикла.

До сих пор, обсуждая цикл трикарбоновых кислот, мы рассматриваем его как основной путь расщепления, обеспечивающий генерирование АТР. Однако цикл трикарбоновых кислот выполняет и другую роль: он поставляет промежуточные продукты для процессов биосинтеза. Например, большинство углеродных атомов в порфиритах происходят из сукцинит – СоА. Многие аминокислоты происходят из -оксоглутарата и оксалоацетата. Здесь же необходимо отметить тот важный момент, что потребление промежуточных продуктов цикла трикарбоновых кислот для целого биосинтеза обязательно должно сопровождаться их пополнением. Предположим, что оксалоацетат превращается в аминокислоты, используемые для биосинтеза белка. Если при этом не будет происходить синтез оксалоацетата, функционирование цикла трикарбоновых кислот прекратится, поскольку ацетил – СоА может включиться в цикл только после конденсации с оксалоакцетатом. Как происходит пополнение оксалоацетата? Млекопитающие лишены ферментативного механизма, обеспечивающего превращение ацетил – СоА в оксалоацетат или другой промежуточный продукт цикла трикарбоновых кислот. Оксалоацетат у них образуется путем карбоксилирования пирувата, катализируемого пируват – карбоксилазой.

Пируват + CO + АТР + Н₂О Оксалоацетат + АDР + P_i+ + 2H⁺.

Карбоксилирование пирувата является примером анаплеротической реакции.

Скорость функционирования цикла трикарбоновых кислот точно пригнана к потребности клеток в АТР. Важной регуляторной реакцией цикла является синтез цитрата из оксалоацетата и ацетата – СоА. АТР - аллостерический ингибитор цитрат–синтеза. Его действие заключается в повышении К_м для ацетил – СоА и в результате уменьшается образование цитрата.

Вторая регуляторная реакция – это реакция, катализируемая изоцитрат - дегидрогеназой. Фермент аллостерически стимулируется ADP, который повышает его сродство к субстратам. Между связыванием изоцитрата, NAD⁺, Mg²⁺, ADP существует взаимная кооперативность. В отличие от этого NADH ингибирует изоцитрат – дегидрогеназу путем прямого вытеснения NAD⁺.

Третьей регуляторной реакцией цикла трикарбоновых кислот является реакция, катализируемая -оксоглутарат – дегидрогеназной. Регуляция на этом этапе в некоторых отношениях подобна регуляции на уровне пируват – дегидрогеназного комплекса, кА и можно было ожидать, исходя из их структурной гомологии. -оксоглутарат – дегидрогеназа ингибируется сукцинит – СоА и NADH, т.е. продуктами катализируемой ею реакции. Она ингибируется также высоким энергетическим зарядом. Коротко говоря, поступление двухуглеродных фрагментов в цикл трикарбоновых кислот и скорость снижаются при высоком содержании АТР в клетке. Эта регуляция достигается участием ряда комплементарных механизмов на различных стадиях цикла.

«Меня часто спрашивали, как возникло и развивалось исследование цикла трикарбоновых кислот. Была ли эта концепция результатом внезапного вдохновения и предвидения?» «Ничего подобного, - отвечал Ганс Кребс, - это был очень медленный эволюционный процесс, развивавшийся в течение пяти лет, начиная с 1932 г…» Кребс вначале изучал скорость окисления различных соединений, используя срезы почек и печени. Он выбирал вещества, представлявшие собою возможные промежуточные продукты при окислении пищевых веществ. Кребс предполагал, что такие вещества будут быстро окисляться, а следовательно, их легко будет идентифицировать. Были получены важные данные: цитрат, сукцинат, фумарат и ацетат быстро окисляются в различных тканях.Существенный вклад в изучение этой проблемы внес Альберт Сент – Дьердьи в 1935 г. Он исследовал окисление различных веществ, используя суспензии измельченной грудной мышцы голубя. Эта очень активная летательная мышца обладает исключительно высокой скоростью окислительных процессов, что ускоряло ход эксперимента С₄ – дикарбоновых кислот повышало потребление О₂ в гораздо большей степени, чем это требовалось для их полного окисления. Иными словами, они каталитически увеличивали потребление О₂ . Такая каталитическая стимуляция дыхания наблюдалась в присутствии сукцинита, фумарата и малата.

Следующим шагом вперед явилась расшифровка биологического пути окисления цитрата Карлом Мартиусом и Францем Кнопом в 1937 г. Они показали, что цитрат изомеризуется в изоцитрат через цис-аконитат и что изоцитрат подвергается окислительному декарбоксилированию в -оксоглутарат.Возможность окисления -оксоглутарата в сукцинит тогда была уже известна, и, таким образом, это открытие позволило установить путь от цитрата до сукцината. Оно подоспело в нужный момент, Кребс смог объяснить свое недавнее наблюдение, что цитрат каталитически усиливает дыхание измельченной грудной мышцы голубя.

Дополнительная важная информация была получена в результате использования малоната, специфического ингибитора сукцинат–дегидрогеназы. Малонат является конкурентным ингибитором этого фермента, поскольку он структурно очень близок сукциниту. К этому времени было известно, что малонат служит дыхательным ядом. Кребс пришел к выводу, что сукцинат – дегидрогеназа может, таким образом, играть ключевую роль в дыхании. В пользу этого предположения говорил тот фактор, что при добавлении цитрата к мышце, отравленной малонатом, в ней накапливается сукцинит. Более того, накопление сукцинита в такой мышце происходит также при добавлении фумарата. Первый из этих экспериментов указывает на физическую значимость пути от цитрат до сукцинита, отличающегося от реакции катализируемой сукцинит – дегидрогеназой.Кребс установил далее, что цитрат быстро образуется в мышечной суспензии при добавлении оксалоацетата. Открытие синтеза цитрата из оксалоацетата позволило Кребсу построить полную схему процесса. Постулированный им цикл трикарбоновых кислот сразу создал ясную картину окисления углеродов. В этой картине нашли свое точное место многие экспериментальные факты – такие, например, как каталитическое усиление дыхания сукцинитом и другими промежуточными продуктами. Примечательно, что цикл трикарбоновых кислот – не единственный и не первый метаболический цикл, раскрытый Кребсом. Шестью годами ранее он показал,что мочевина превращается по циклическому метаболическому пути, названному орнитиновым циклом. Таким образом, концепция циклического метаболического пути уже была полностью осознана Кребсом, когда он анализировал данные и определял ход экспериментов, которые привели к предложенному им циклу трикарбоновых кислот.

Цикл трикарбоновых кислот представляет собой конечный общий путь для окисления топливных молекул. Он служит также источником строительных блоков для процессов биосинтеза. Большинство топливных молекул вступают в цикл в виде ацетил – СоА. Окислительное декарбоксилирование пирувата, приводящее к образованию ацетил – СоА, является связывающим звеном между гликолизом и циклом трикарбоновых кислот. Эта реакция и все реакции цикла протекают в митохондриях в отличие от гликолиза, который происходит в цитозоле. Цикл начинается с конденсации оксалоацетата (С₄) и ацетил – СоА (С₂) с образованием цитрата (С₆), который изомеризуется в изоцитрат (С₆) . Окислительное декарбоксилирование изоцитрата дает -оксоглутарат (С₅). Вторая молекула СО₂ выделяется в следующей реакции, в которой -оксоглутарат подвергается окислительному декарбоксилированию в сукцинит – СоА (С₄). Триоэфирная связь сукцинит – СоА в присутствии P_i расщепляется с образованием сукцинита и одновременно генерированием высокоэнергетической фосфатной связи в форме GTP или АТР. Сукцинит окисляется в фумарат (С₄), который затем гидратируется в малат (С₄). Наконец, малат окисляется, приводя к регенерированию оксалоацетата (С₄). Таким образом, два атома углерода поступают в цикл в виде ацетил – СоА и два атома углерода покидают цикл в виде СО₂ при последовательных реакциях декарбоксилирования, катализируемых изоцитрат – дегидрогеназной и - оксоглутарат – дегидрогеназой. В четырех окислительно–восстановительных реакциях цикла три пары электронов переносятся на NAD⁺ и одна пара-на FAD. Эти восстановительные переносчики электронов окисляются затем в цепи переноса электронов,что сопровождается генерированием одиннадцати молекул АТР. Кроме того, одна высокоэнергетическая фосфатная связь образуется непосредственно в цикле трикарбоновых кислот. Следовательно,на каждый двухуглеродный фрагмент, который полностью окисляется до Н₂О и СО₂, происходит генерирование двенадцати высокоэнергетических фосфатных связей.Цикл трикарбоновых кислот функционирует только в аэробных условиях, поскольку для него необходимо поступление NAD⁺ и FAD. Эти переносчики электронов регенерируют при переносе NADH и FADH₂ на О₂ по электрон – транспортной цепи, сопровождающемся одновременно образованием АТР. Важное значение имеет регуляция трех ферментов цикла. Высокий энергетический заряд понижает активность цитрат – синтазы, изоцитрат – дегидрогеназы и - оксоглутарат – дегидрогеназы. Еще один важный регуляторный пункт – необратимое образование ацетил – СоА из пирувата. Активность пируват–дегидрогеназного комплекса контролируется путем: 1) ингибирования продуктами реакции; 2) регуляции нуклеотидами по принципу обратной связи; 3) ковалентной модификации. Эти механизмы дополняют друг друга в снижении скорости образования ацетил – СоА при высоком энергетическом заряде клетки.