VI. Микробиологическая диагностика

     Материалом для исследований служит: гной, кровь, отделяемое слизистой оболочки, спинномозговая жидкость, мокрота, моча, а при пищевых отравлениях – рвотные массы, промывные воды желудка.

     Взятие исследуемого материала зависит от предполагаемой локализации с учетом патогенеза и клинической картины болезни. Отбор патологического материала обычно выполняют стерильными квачами, которые вносят в пробирку с транспортной питательной средой для контроля стерильности (СКС). Из закрытых гнойных очагов материал берут с помощью шприца. Мокроту, мочу, рвотные массы и промывные воды желудка помещают в стерильные пробирки, банки. Кровь засевают непосредственно у постели больного в питательную среду на основе СКС в соотношении 1:10.

     Используют микроскопический, бактериологический и серологический методы.

     Микроскопический метод. Из исследуемого материала (исключая кровь) готовят мазки, окрашивают по Граму. Стафилококки имеют шаровидную форму, диаметром 0,5-1,5 мкм, грамположительные. Располагаются в мазках чаще всего в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда. Также они могут располагаться в одиночку, парами, короткими цепочками.

     Микроскопическое исследование не позволяет идентифицировать стафилококки, но дает возможность сориентироваться в выборе питательных сред для выделения чистой культуры бактерий.

     Бактериологический метод. Включает выделение чистой культуры микробов из исследуемого материала и их идентификацию.

     Патологический материал высевают на кровяной агар (гемолиз), желточно-солевой агар (для выявления пигмента и лецитиназы) и инкубируют в термостате в течение 18-24 часов при температуре 37ºС.

     Через сутки изучают колонии, выросшие на питательной среде. Стафилококки образуют выпуклые непрозрачные колонии средней величины (1-3 мм), гомогенной структуры, гладкие с ровными краями.

     Колонии S. aureus на кровяном агаре окружены зоной гемолиза и часто имеют золотистый пигмент. На желточно-солевом агаре (ЖСА) колонии этого вида стафилококков окружены радужным венчиком помутнения среды, поскольку эти микроорганизмы способны продуцировать лецитиназу.

     Из изолированной колонии готовят мазок, окрашивают по Граму, микроскопируют. Оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный мясопептонный агар и ставят его в термостат для увеличения количества выделенных микробов. Через 18-24 часов из микробного налета, образовавшегося на скошенном агаре, готовят мазок, окрашивают по Граму, микроскопируют. Убедившись, что культура выделенных микробов чистая, приступают к изучению комплекса их биологических свойств с целью видовой идентификации стафилококков.

     Для дифференцировки S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus ставят реакцию плазмокоагуляции, определяют ДНК-азную активность, фосфатазу, способность расщеплять маннит в анаэробных условиях, вызывать некроз кожи кролика.

     Реакция плазмокоагуляции. Появление желеобразного сгустка свидетельствует о наличии у изучаемого штамма фермента плазмокоагулазы.

     Определение ДНК-азы. На поверхность мясопептонного агара, содержащего ДНК, высевают штрихом суточную агаровую культуру стафилококка и помещают в термостат на 24 часа. После инкубации поверхность агара заливают 1 н раствором соляной кислоты. Если стафилококки продуцируют ДНК-азу, то вокруг колоний остается зона просветления.

     Определение фосфатазы. На чашку с фенолфталеиновым агаром высевают выделенную культуру стафилококка. Колонии, выросшие через 18-24 часов, обрабатывают парами аммиака. Появление розовой окраски колоний свидетельствует о положительной реакции.

     Для установления источника инфекции определяют фаговар патогенных стафилококков. Штаммы S. aureus различаются по чувствительности к стафилококковым фагам. Для типирования S. aureus используют международный набор из 23 умеренных фагов, которые разделены на 4 группы.

     Отношение стафилококков к фагам своеобразное: один и тот же штамм может лизироваться либо одним фагом, либо одновременно несколькими. Но поскольку чувствительность их к фагам является признаком относительно стабильным, фаготипирование стафилококков имеет важное эпидемиологическое значение. Недостаток этого метода состоит в том, что типированию поддается не более 65-70% S. aureus.

     В последние годы получены наборы специфических фагов и для типирования S. epidermidis.

     Серологический метод, как правило, применяется в диагностике затяжных, хронических форм заболевания. Информативными показателями является обнаружение антител к факторам патогенности стафилококков: токсинам, ферментам, тейхоевой кислоте и др. в РПГА и ИФА.

     Экспресс-диагностика направлена на обнаружение серологическими реакциями антигенов ферментов патогенности и токсинов стафилококка, а также определения tox-гена в ПЦР.

     Для определения энтеротоксигенности стафилококков используют несколько методов.

     1. Серологический – с помощью специфических антитоксических сывороток в реакции преципитации в геле обнаруживают энтеротоксин и устанавливают его тип. Серологический метод обнаружения энтеротоксина является наиболее простым и чувствительным.

     2. Биологический – внутривенное введение фильтрата бульонной культуры стафилококка котятам в дозе 2-3 мл на 1 кг веса или им дают остатки пищи или вводят в желудок через зонд выделенную культуру стафилококка. В случае наличия в исследуемом материале энтеротоксина у котят через 30-60 минут наступает рвота и понос.