Биохимия пособие Коновалова 2012

бел

изменяется константа преломления света, и появляется граница

бздела Фаз- По lDC числу судят о количестве фракций или об однород­

ности белка.

К этой группе методов относится и гель-фильтрация, используюзя полимеры сефадексы, построенные из нитевидных молекул поли­ сахарид3 декстрана, сшитых через определенные промежутки поперечНЬ1МИ связями и свернутых в виде гранул. Образуется молекулярное си­

то с контролируемым размером отверстий. Выпускаются марки сефадексое:

G - 200 (пропускают белки с М.м. 200000 Да и <). G - ЮО (-//- 100000 Да и <).

G - 75 (-//—50000 Да и <).

G - 50 (-//- 10000 Да и <).

G - 25 (-//- 4000 Да и <).

Гелем сефадекса заполняют колонку и в нее вводят смесь белков. Сверху постоянно подают ток растворителя. Молекулы, размер которых меньше отверстий, легко диффундируют в гранулы. Под влиянием тока жидкости молекулы выходят из гранул и заходят в следующие. Поэтому молекулы движутся медленнее тока жидкости. Молекулы больших раз­ меров не могут пройти в гранулы, обтекают их и проходят через колон­ ку без задержки. Собирая вытекающую жидкость малыми порциями, можно разделить белки на фракции. Это очень эффективный метод фракционирования веществ.

Белки —заряженные вещества. В зависимости от величины за­ ряда и молекулярной массы они имеют разную скорость передвижения в электрическом поле. На этом основан метод электрофореза. Он про­ водится в буферном растворе с определенным значением pH (вероналмединаловый —рН=8,6). Возможен бумажный электрофорез и в геле: полиакриламидном, крахмальном. Разделение в гелях более тонкое, так как они играют роль молекулярного сита, а не только опорной среды, т.е. здесь имеют значение величина заряда и величина частиц.

Эффективными методами разделения и идентификации химиче­ ских соединений, в том числе и белков, являются хроматографические методы. Метод хроматографии был разработан в 1906 году русским ботаником М.С. Цветом, который разделял растительные пигменты. В настоящее время используются четыре основных вида хроматографии:

1)Адсорбционная.

2)Распределительная.

3)Ионообменная.

4)Аффинная

Разработаны различные приемы их применения в зависимости от Решаемых задач: от идентификации каких-либо веществ до получения Даже больших количеств чистого вещества. Хроматографическое разде­

41

ление веществ может проводиться с использованием разных носителей на колонках (колоночная хроматография), на бумаге (бумажная), в тоц, ком слое сорбента (чаще всего с использованием силикагеля - тонкое, лойная), газовая.

Адсорбционная хроматография основана на различной полярно, сги веществ и их индивидуальной способности связываться с адсорбец. том взаимодействием разного типа.

Распределительная хроматография основана на использовании подвижной и неподвижной (стационарной) фаз, представляющих две несмешивающиеся жидкости, взятые в определенном соотношении. Не­ подвижная фаза закрепляется на каком-либо твердом инертном носите­ ле, в качестве которого могут использоваться силикагель, целлюлоза, фильтровальная бумага Через твердый носитель пропускается подвиж­ ная фаза. Коэффициент распределения веществ в этих жидкостях (под. вижной и неподвижной фазах ) будет разным. Поэтому при пропуска­ нии растворителя через колонку с адсорбентом или бумагу с нанесенной смесью разделяемых веществ (стационарная фаза на носителе) в зави­ симости от распределения в подвижной и неподвижной фазах вещества будут двигаться с разной скоростью, т.е. происходит их разделение.

В целом метод был назван жидкостной хроматографией. При ис­ пользовании в качестве твердого носителя фильтровальной бумаги хро­ матография называется бумажной. Это один из наиболее эффективных аналитических методов разделения веществ. Жидкостная распредели­ тельная хроматография на бумаге используется для разделения многих типов веществ, включая углеводы, липиды, нуклеотиды, белки, пепти­ ды. Разработаны различные модификации этого метода с использовани­ ем разных носителей (окиси алюминия, производных целлюлозы, крем­ незема), а также самых разнообразных растворителей. К таким разно­ видностям относится тонкослойная хроматография, при которой смесь веществ разделяется с помощью восходящей хроматографии на твердом носителе, нанесенном на стеклянную или пластмассовую пластинку.

Другой модификацией распределительной хроматографии явля­ ется газожидкостная хроматография, особенно пригодная для разделе­ ния легко летучих веществ. В этом методе колонка заполняется тонкоизмельченными частицами инертного твердого носителя (например, ог­ неупорный кирпич), пропитанными нелетучими жидкостями (смазоч­ ными или силиконовыми маслами, др.). В колонке по всей длине под­ держивается высокая температура (170-225°). Смесь анализируемых ле­ тучих веществ вводится в верхнюю часть колонки и быстро там испаря­ ется. Пары веществ проходят через колонку, увлекаемые равномерным потоком инертного газа (азота, аргона, гелия). Компоненты смеси дви­ жутся по колонке с разными скоростями в зависимости от коэффициен­ тов распределения между газом (подвижная фаза) и нелетучей жидко-

42

/неподвижная фаза). Наличие разделяемых веществ в потоке газа, сТЬ,° щего из колонки, обнаруживается физическими или химическиВЬ1Х°егодамнРезультаты автоматически записываются на диаграммной

в виде серии пиков.

ле1Г1 Ионообменная хроматография основана на различиях в приролойизированных групп белков. Здесь используются ионообменные Де имеры на целлюлозной основе, представляющие высокополимерный П кас, химически соединенный с заряженными группами, способными связывать ионы за счет электростатического взаимодействия. Они спо­ собны обменивать эти ионы на ионы, содержащиеся в водном растворе. Сшивка цепей в каркасе полимера очень частая, и молекулы белков не могут проникать внутрь полимера, а взаимодействуют лишь на поверх­

ности с ионизированными группами.

различают катионо- и анионообменники. Примером катионообменников является карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), т.е. целлюлоза, к ОН-группам которой пришиты группы -CHy-COOH. При ее обработке щелочью образуется солевая форма -O-CHr-COONa, в которой катион Na+ может обмениваться на другие катионы, в том числе и белковые. Примером анионообменников является ДЕАЕ - целлюлоза (диэтилами- ноэтил-целлюлоза),

Ц ---- О ---- сн2— сн2____ N ^CH2CH3

чсн2сн3

при обработке которой щелочью или кислотой образуется солевая фор­ ма, имеющая анион:

Эти анионы могут обмениваться на другие, в том числе и белко­ вые. Разная способность белков связываться с ионообменником зависит от количества и природы заряженных групп в белках. Анионообменни­ ки используются для разделения кислых и нейтральных белков, катионообменникигосновных.

Элюция белков с йонообменников проводится раствором с высо- к°й концентрацией солей (NaCl). Первыми снимаются белки, обладаю­ щие меньшим сродством к ионообменнику, а затем с большим.

Аффинная или хроматография по сродству основана на изби­ рательном взаимодействии белка со специфическими веществами - линЩЩами, пришитыми к носителю. Роль лиганда могут выполнять суб- ^аты (при выделении ферментов), гормоны, коферменты и др.; в ре­ зультате высокой специфичности белка к данному лиганду происходит выДеление из смеси только данного белка. Элюция белка с носителя °сУЩествляется раствором с высокой концентрацией лиганда.

43

5.Очистка белка от электролитов —методом диализа или с по­ мощью сефадексов (G-25).

6.Оценка полноты очистки белка, т.е. проверка на гомоген­

ность.

Для проверки степени очистки индивидуального белка использу­ ют методы:

-Кристаллизации.

-Ультрацентрифугирования (наличие только одной границы раз­ дела фаз).

-Диск - электрофореза (белок движется в виде одной узкой поло­

сы).

-Иммунохимического анализа (имеется одна полоса преципита­ ции с антисывороткой, полученной от животных, иммунизиро­ ванных исследуемым белком).

-Проба на постоянство растворимости (в одинаковых условиях растворимость чистого белка должна быть постоянной и не зави­ сеть от количества растворяемого белка).

Если белок нужно получить в сухом виде, его высушивают в ва­

кууме при одновременном замораживании —метод лиофилизации. По­ лученные сухие препараты могут долго сохраняться.

Различия белкового состава органов и изменение его при онтогенезе и болезнях

Белковый состав организма взрослого человека более или менее постоянный, но белковый состав отдельных органов и тканей отличает­ ся. Так, в эритроците содержится гемоглобин, в мышечных клетках - сократительные белки —актин, миозин, в клетках сетчатки глаза —ро­ допсин. Все эти белки выполняют специфические функции. Многие белки содержатся во всех или почти во всех клетках, но в разных коли­ чествах. При заболеваниях белковый состав тканей изменяется, и такие проявления заболевания называют протеинопатией.

Протеинопатии относятся к молекулярным болезням, развиваю­ щимся вследствие образования дефектного белка (полностью или час­ тично утратившего свои функции) или явно недостаточного количества нормального белка, не способного в полном объеме выполнять свои функции. Таким образом, протеинопатии - это «болезни» специфиче­ ских белков. Их можно разделить на две большие группы: ферментные (ферментопатии или энзимопатии) и неферментные. К первой группе относятся заболевания, связанные с дефектами ферментов, что приво­ дит к нарушению определенного звена обмена веществ. Вторая группа протеинопатий связана с дефектами неферментных белков, выполняю­ щих какие-то определенные функции (транспортную, рецепторную,

44

Мпкетонурия, алкаптонурия, тирозиноз, альбинизм), гликогена (глико- Н нозЫ и агликогенозы), галактозы (галактоземия), и других веществ. Классическим примером неферментных протеинопатий являются гемо­ глобинопатии, связанные с генетическими дефектами субъединиц гемо­ глобина. Среди них хорошо изучена серповидноклеточная анемия, при которой в крови больных содержится аномальный гемоглобин HbS. Он отличается от нормального гемоглобина НЬА тем, что в 0- субъединицах вместо отрицательно заряженной глутаминовой кислоты в шестом положении находится валин (гидрофобная аминокислота) вследствие мутации в структурном гене ДНК, кодирующем 0- субъединицу гемоглобина. Подобная замена сказывается на физико­ химических свойствах молекулы, что проявляется уменьшением рас­ творимости дезоксигемоглобина. Он может выкристаллизовываться в эритроцитах, которые принимают форму серпа (отсюда и название бо­ лезни), могут закупоривать капилляры, погибают. Нарушается снабже­ ние тканей кислородом. Распад эритроцитов приводит к анемии (мало­ кровию). Заболевание может привести к неблагоприятному исходу. Протеинопатии могут быть наследственными и приобретенными.

В процессе развития организма - в разные периоды жизни (при онтогенезе) белковый состав также изменяется. Так, у плода имеется НЬ F, а после рождения он заменяется на НЬ Ап

ФЕРМЕНТЫ. СТРОЕНИЕ. КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

1. Особенности биокатализаторов

Ферменты —это белковые катализаторы биохимических реакций. Между ферментами и неорганическими катализаторами есть сходства и Различия (связанные с белковой природой ферментов).

Общие свойства ферментов и неорганических катализаторов: 1- Подчинение закону действующих масс.

2.Не сдвигают подвижного равновесия реакции, т.е. ускоряют как прямую, так и обратную реакцию.

3.Влияют только на скорость химических реакций.

45

4.Выходят из реакции в неизменном виде.

5.Не ускоряют термодинамически невозможных реакций.

Отличия ферментов от неорганических катализаторов:

1.Ферменты действуют в «мягких» условиях внутренней среды организма.

2.Ферменты это белки, поэтому они чувствительны к действию денатурирующих агентов.

3.Высокая эффективность ферментов. (Сравним энергии актива­ ции разложения перекиси водорода: спонтанно - 75,2 кДж/моль; а в присутствии катализатора платины - 50,2 кДж/моль; фермента каталазы

-8,3 кДж/моль).

4.Катализаторы всегда проявляют максимальную активность: активность ферментов (Е) зависит от условий в клетке.

5.Катализаторы ускоряют достижение химического равновесия, активируя как прямую, так и обратную реакцию. Каждый отдельный фермент действует аналогично. Однако в живых клетках имеют место полиферментные реакции:

С->D -> F

А—> В

L - + M - 4 N

Совокупность ферментов в реальной клетке дает направление обмену веществ, т.е. превращение субстрата А в конечные продукты F или N зависит от набора ферментов 1 или 2 пути превращения.

6.Активность ферментов регулируется на генетическом уровне, а также низкомолекулярными соединениями - эффекторами.

7.Ферменты обладают специфичностью действия.

Специфичность действия ферментов

Различают специфичность по отношению к типу химической ре­ акции, катализируемой ферментом, и специфичность по отношению к субстрату. Эти два вида специфичности присутствуют у каждого фермента.

Специфичность по отношению к субстрату

Это предпочтительность фермента к субстрату определенной структуры по сравнению с другими субстратами. Различают 4 вида суб­ стратной специфичности:

1. Абсолютная —фермент катализирует превращение строго опре-

46

го одного субстрата. Например, уреаза расщепляет только моДеЛ«^у°аргиназа - аргинин.

ЧвВП 2 Относительная — фермент катализирует превращение не­ ких субстратов, имеющих один тип связи. Например, липаза сК0ЛЬпляет сложноэфирную связь между глицерином и любой жирной

кислотой в триацилглицеринах.

ки ^ Относительная групповая - фермент катализирует превраще- я е с к о л ь к и х субстратов, имеющих один тип связи, но требуются 1016еделенные атомные группировки, образующие эту связь. НаприоПР все протеолитические ферменты расщепляют пептидную связь, но пепсин - образованную -NH2 группами ароматических аминокислот, химотрипсин - образованную -СООН группами этих же аминокислот, трипсин - пептидную связь, образованную -СООН группой лизина, ар­

гинина.

4. Стереохимическая —фермент катализирует превращение толь­ ко одного сгереоизомера при наличии их смеси. Например, L оксидаза превращает L аминокислоту, но не действует на Д-изомер.

У Специфичность по отношению к реакции

Каждый фермент катализирует одну реакцию или группу реакций одного типа. Часто одно и то же химическое соединение выступает как субстрат для разных ферментов, причем каждый из них, катализируя специфическую для него реакцию, приводит к образованию разных продуктов. Например:

Н

NH,

Специфичность к типу реакции лежит в основе единой классифи­ кации ферментов.

^О собенности выделения ферментов

Для выделения ферментов используют методы выделения инди­ видуального белка. При этом требуются особо щадящие условия. Пред­ почтителен метод афинной хроматографии (см. лекцию «Методы выде­ ления количественного определения белка»).

47

2. Структурная и функциональная организация ферментов

По строению различают простые ферменты (при гидролизе об­ разуются только аминокислоты) и сложные (при гидролизе образуются аминокислоты и добавочные группы).

Белковая часть фермента называется апофермент, небелковая - кофактор. Прочный природный комплекс апофермента и кофактора - холофермент.

Типы кофактора: а) простетическая группа - прочно связанная с апоферментом небелковая часть, часто связь ковалентная и в качестве небелковой части выступают металлы, б) кофермент - небелковая часть, легко отделяемая от апофермента, рыхло связанная с ним. Часто коферментами служат витамины.

У каждого фермента имеется активный центр.

Активный центр фермента образован: у простых ферментов функциональными группами боковых радикалов аминокислот, сбли­ женных в пространстве. У сложных ферментов: + кофактор.

Примеры функциональных групп активного центра:

Участки активного центра:

-Якорный - для фиксации субстрата.

-Каталитический - обеспечивает катализ.

Свойства активных центров

1.Это трехмерное образование, в формировании активного центра участвуют функциональные группы аминокислот, линейно далекие друг от друга.

2.На активный центр приходится относительно малая часть об­ щего объема фермента.

3.Активный центр имеет форму узкого углубления или щели, что создает микроокружение, благоприятное для катализа.

4.Субстраты относительно слабо связываются с активным цен­

тром.

5.Специфичность связывания субстрата зависит от строго опре­ деленного расположения атомов в активном центре.

Уряда регуляторных ферментов имеется еще один центр —алло­ стерический. Alios - другой, stereos —пространство, т.е. это центр, за­ нимающий другое пространственное положение, чем активный центр.

4 8

«соединение к этому центру низкомолекулярных веществ (эффекто- , ведет к изменению третичной структуры фермента и области ак­

тив1^ 0 центра, что приводит к изменению активности фермента.

3. Механизм и стадии ферментативного катализа

Химическая реакция - это результат столкновения молекул, котооый зависит от величины энергии молекул и от прочности той связи межДУ атомами в молекуле, которая должна быть разорвана Молекул с очень низкой и очень высокой энергией мало, большинство молекул об­ ладает средним запасом энергии. Они и определяют скорость реакции.

Способы ускорения химических реакций: 1. Увеличить среднюю энергию молекул 2. Снизить энергетический барьер реакции

Энергетический барьер реакции —это значение энергии, когда все молекулы взаимодействуют.

Энергия активации —количество энергии, необходимое для того, чтобы все молекулы смогли провзаимодействовать (преодолеть энерге­ тический барьер).

В общем виде уравнение химической реакции в присутствии фер­ мента можно записать

E + S o E S o EZ -» ЕР -» Е + Р,

где Е - фермент, S —субстрат, Р - продукт, Z - промежуточный комплекс.

Ферментативная реакция протекает в три стадии:

I стадия: E + S # ES —образование фермент-субстратного ком­ плекса. Протекает очень быстро. Субстрат присоединяется к якорному участку активного центра. В 1894 г. Фишер предложил модель взаимо­ действия фермента с субстратом «ключ-замок», т.е. субстрат подходит к ферменту как ключ к замку. Согласно этой модели у фермента имеет­ ся окончательно сформированный активный центр еще задолго до взаимодействия с субстратом. Эта модель объясняла абсолютную спе­ цифичность фермента и не могла объяснить относительной, поэтому Кошланд предложил модель «индуцированного соответствия». Со­ гласно этой модели, окончательное формирование активного центра Фермента происходит в момент взаимодействия с субстратом, т.е. при связывании субстрата с якорным участком активного центра про­ исходит изменение конформации каталитического участка актив­ ного центра, обеспечивающее его комплементарность поверхности субстрата.

49

Причины ускорения реакции на I стадии:

1.Происходит сближение и правильная ориентация молекул суб. страта в области активного центра фермента,

2.Это приводит к увеличению эффективной концентрации молекул субстрата (т.е. тех молекул, которые взаимодействуют), т.к. в рас. творе без фермента их столкновения были случайны.

Пстадия: на стадии фермент-субстратного комплекса происхо­ дит химическая реакция через переходное состояние ES —> EZ, где Z- это уже не субстрат, но еще и не продукт. Именно эта стадия лежит в основе субстратной специфичности фермента. Неспецифические (не­ продуктивные) взаимодействия субстрата с ферментом нарушаются при образовании переходного состояния, при специфическом взаимодейст­ вии на стадии переходного состояния происходит резкое увеличение скорости реакции. На этой стадии происходит ускорение реакции вследствие уменьшения энергии активации.

Причины снижения энергии активации:

1.Фермент передает часть своей энергии субстрату в ходе взаим­ ной подгонки конформации субстрата и фермента. Субстрат в ходе взаимодействия с активным центром фермента деформируется (растя­ гивается на активном центре как на «дыбе» - гипотеза «дыбы»), что об­ легчает разрыв его связей.

2.Уменьшается энергетический барьер реакции путем разбивки ее на ряд промежуточных стадий, каждая из которых имеет низкий энерге­ тический барьер.

►

50