Биохимия пособие Коновалова 2012

делением ненасыщенных жирных кислот. Нечто подобное проис- г°°аГ и в животном организме. Аутоокисление жиров, протекающее в ган*х и тканях’ называют липидной пероксидацией, так как этот 0Роаесс происходит с образованием перекисей и гидроперекисей нена- ^ пенных жирных кислот. Пероксидация жирных кислот может быть С ицннрована любым веществом, способным «атаковать» и захватывать й водорода метиленовой группы, оставляя, таким образом, несла­ бый электрон при углероде. Удаление водорода протекает легче у Метиленовой группы, находящейся в непосредственной близости к не­ насыщенной связи (углеродные атомы, вовлекаемые в пероксидацию,

помечены в приведенной ниже формуле):

О

II

О c ^ o c x ^ v ^ V W

CH2°GVAV ^W Z Y rV 3v/

Чем больше содержится в жирной кислоте ненасыщенных связей, тем интенсивнее протекает ее пероксидация. Пероксидацию относят к категории свободнорадикального окисления; ее активно ини­ циируют постоянно возникающие в животных тканях первичные кисло­ родные радикалы, такие, как 02~ (супероксид), Н 02* (гидроперекисный радикал), НО' (гидроксильный радикал), взаимодействие с которыми приводит к переносу радикального состояния на молекулу жирной ки­ слоты, т. е. к образованию липидных радикалов и перекисей.

Процесс пероксидации жирной кислоты включает следующие 3 стадии:

I стадия —инициация (образование свободного липидного ради­ кала R" из предшественника):

RH+ X" -> R4-XH

где RH - ненасыщенная жирная кислота, входящая в состав триа- Цил-глицеринов, фосфолипидов, эфиров холестерина;

Х‘- первичный свободный радикал.

I стадия пероксидации может быть представлена в следующем ви­

де:

131

На этой стадии окисление полиненасьпценных жирных кислот может завершаться перегруппировкой разделенных метиленовой груд.

х- ,хн

я

н н

RH

пой двойных связей в сопряженную диеновую и даже триеновую структуру. Образуются так называемые конъюгированные диены и триены, определение которых иногда проводят для оценки интенсивности перекисного окисления липидов.

II стадия - развитие цепных реакций. Образовавшийся липидны радикал (R), быстро реагирует с молекулярным кислородом.

R- + О г -*■ R —O O R - ОО- + RH -► R —ООН + R" ит.д.

Как видно, перекисный радикал R-OO' вступает во взаимодейст­ вие с новой молекулой ненасыщенной жирной кислоты (RH); при этом образуется липидная гидроперекись R-ООН и вновь появляется свобод­ ный липидный радикал R*. Это придает всему процессу пероксидации цепной характер. Схематически эта стадия пероксидации представля­ ется в следующем виде:

Часть липидных гидроперекисей подвергается распаду, давая об­ разование различных альдегидов, в том числе и малонового. Определе­ ние последнего часто используют для оценки пероксидации в целом.

О — О

■*

Эндоперекн сь

н ООН

О О

+R" А Л

н н

Гидроперекись

Малонокык

днальдегнд

Другая часть гидроперекисей образует свободные радикалы:

132

R OOH+—» R —О* + НО"

R - ООН + Fe2+ -*■R - О* + НО- + Fe3+

Последние вступают во взаимодействие с новыми порциями жир­ ных кислот, придавая цепной реакции лавинообразный характер. Счита- ^гсЯ цто именно гидроперекиси жирных кислот (R-ООН) являются главным пусковым механизмом пероксидации. Развитию процесса способствует наличие ионов двухвалентного железа и других переход­ ных металлов, например, меди.

Добавление этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), связы­ вающей ионы этих металлов, активно задерживает пероксидацию in vi­

tro.

III стадия - завершение (образование продуктов, не содержащи свободных липидных радикалов).

Часть свободных радикалов рекомбинирует друг с другом, обра­ зуя неактивные продукты:

R' + R* —» R - R

R - ОО- + R' -> R - ОО - R

На этой стадии, собственно, и завершается пероксидация жирных кислот. Очень сходно подвергаются пероксидации ненасыщенные жир­ ные кислоты, входящие в состав фосфолипидов и эфиров холестерина.

н

|к -O -O -R|

R - O O + R - O O - + R - O O - R + O 2

Наиболее устойчивы к пероксидации сфингомиелины, харак­ теризующиеся наименьшей ненасыщенностью входящих в них жирных кислот (нервная ткань, мозг!). По сообщениям Е. М. Крепса (1981), в мозговой ткани мамонтов, пролежавших свыше 40000 лет в условиях

133

вечной мерзлоты в Сибири, сфингомиелины полностью сохранились, тогда как глицерофосфолипиды разрушились, вероятно, в результате окислительной деградации.

Перекисное окисление липидов (ПОЛ) в организме происходит не только спонтанно, но и в результате ряда ферментных реакций. Приме­ ром может служить окисление полиненасыщенных жирных кислот, протекающее в тромбоцитах и лейкоцитах при действии микросомных липоксигеназ. Если жирная кислота содержит не менее трех двойных связей, то при ее окислении липоксигеназами одним из конечных про­ дуктов является малоновый диальдегид (МДА) (например, при превра­ щении арахидоновой кислоты в простагландины в тромбоцитах).

4. Активные формы кислорода (АФК)

Основное количество потребляемого 0 2(95-98%) расходуется на выработку энергии и окислительный катаболизм субстратов. Относи­ тельно небольшая часть (2-5%) переходит в активные формы кислорода (АФК) и затем частично используется для окислительной модификации (ОМ) макромолекул.

Термин “АФК” шире, чем “свободные радикалы кислорода” (02'-, НО-), так как кроме последних включает также молекулы Н20 2, синглетный кислород 10 2, озон Оэ и гипохлорит НОС1.

АФК генерируются во всех частях клетки. Наибольший вклад вно­ сит дыхательная цепь митохондрий, особенно при низкой концен­ трации АДФ. Важна роль и системы цитохрома Р450, локализованной в эндоплазматической сети. Участвуют ядерная мембрана и другие части клетки, при этом АФК часто возникают не только спонтанно, но и фер­ ментативно (НАДФН-оксидаза дыхательного взрыва в плазматической мембране и ксантиноксидаза в гиалоплазме). АФК вызывают образова­ ние органических гидропероксидов ROOH - ДНК, белков, липидов, а также малых молекул. ROOH образуются и в реакции с обычным моле­ кулярным 02 при участии ферментов диоксигеназ или циклооксиге­ наз:

RH + 0 2—►ROOH

ROOH по своей структуре подобны Н20 2(R-O-O-H и Н-О-О-Н) и химически тоже активны, при последующем метаболизме они перехо­ дят в спирты, альдегиды, эпоксиды и другие окисленные соединения. Образование гидропероксидов называют перекисным окислением (пероксидацией), а совокупность изменений, происходящих в молекулах под действием АФК, называют окислительной модификацией моле­ кул (ОМ).

134

На протяжении многих лет перекисное окисление липидов (ПОЛ) чцтали преимущественно спонтанным (неферментативным) и неспецифическим самоускоряющимся процессом и ему придавали ведущее яачение в ОМ и ее последствиях. Однако затем стало ясно, что: 1) ог- оомное значение имеют и ферментативные реакции, катализируемые липоксигеназами и циклооксигеназами - первыми ферментами путей, приводящих к образованию специфических регуляторов - эйкозаноидов; 2) большое значение имеет ОМ и других макромолекул - ДНК и белков, усиленно изучаемая в 90-е годы.

Биологическое значение

Долгое время основной акцент делали на вредных эффектах АФК и ОМ. Они действительно существуют, но теперь уже нет сомнений, что образование АФК и ОМ приносит и пользу.

Эйкозаноиды —это гормоны, производные С20—полиненасьпцен- ных жирных кислот типа арахидоновой. Их разделяют на циклические (простаноццы) и линейные (прежде всего лейкотриены). Промежуточ­ ными метаболитами являются пероксиды. Простаноиды защищают от повреждений клетки желудка, сердца и других органов. Лейкотриены, как и простаноиды, способствуют развитию воспаления (первично это полезная защитная реакция).

Серьезной проблемой для многоклеточных организмов является борьба с клетками-врагами. Важную роль в этом играют фагоциты (нейтрофилы и макрофаги), которые захватывают микроорганизмы, а затем убивают их, используя АФК в качестве основного оружия, повре­ ждающего макромолекулы и мембраны путем их ОМ. Макрофаги раз­ рушают поврежденные, старые или иммунологически несовместимые клетки, а также способствуют уничтожению злокачественных клеток и клеток, пораженных вирусами. Остеокласты (специализированные макрофаги) применяют АФК для разрушения кости —обязательного ус­ ловия ее обновления. Во всех этих случаях клетки-защитники быстро поглощают большое количество 02 (дыхательный взрыв) и затем ис­ пользуют его для образования АФК при помощи расположенной в плазматической мембране НАДФН-оксидазы дыхательного взрыва:

2 0 2+ НАДФН -► 2 0 Г + НАДФ+ + Н+

Важное значение АФК для защиты от бактерий доказывается тем, что при инактивирующей мутации этого фермента возникает хрониче­ ский септический грануломатоз: фагоцитированные микроорганизмы остаются живыми, что приводит к повторным хроническим инфекциям. Н20 2 используется также для окисления галоген-анионов: в нейтрофи­

135

лах СГ —для образования мощного окислителя гипохлорита НСЮ, так­ же убивающего бактерии, а в щитовидной железе —J", что необходимо для синтеза гормонов иодгиронинов.

В последнее время обнаружены новые функции АФК - регуля­ торные. АФК стимулируют накопление в клетке вторичных посредни­ ков - циклонуклеотидов: цАМФ и цГМФ. АФК вызывают накопление ионов Са2+ в цитозоле и стимуляцию фосфорилирования белков в ре­ зультате активации протеинкиназ (особенно протеинкиназы С) и протеинтирозинкиназ и ингибирования протеинфосфатаз; активируют белок Ras, играющий важную роль в передаче сигналов в ядро клетки. Актив­ но исследуется, не могут ли АФК сами прямо выполнять функции вто­ рых посредников гормонов.

АФК и липидные ROOH в низких субтоксических концентрациях индуцируют такие процессы, как экспрессия генов и деление клеток. Н20 2, накапливающаяся при инвазии вирусов и бактерий, приводит к индукции ряда цитокинов и иммунных рецепторов и в результате к им­ мунным и воспалительным ответам, а также к индукции белков острой фазы воспаления и адгезии (последние способствуют выходу лейкоци­ тов в ткани, что важно при воспалении). Очевидно, роль АФК в защите организма шире, чем предполагалось ранее: она включает не только фа­ гоцитоз опасных клеток, но и запуск других воспалительных реакций и иммунных процессов.

Патологические последствия возникают при чрезмерном накопле­ нии АФК, пероксидов и их вторичных продуктов —состоянии, называе­ мом обычно оксидативным стрессом, а факторы и вещества, способст­ вующие этому, называют прооксидантами. Факторы, вызывающие оксидативный стресс, различны, но все они, в конечном счете вызывают ОМ макромолекул. Прежде всего это избыток 0 2, особенно при гипер­ барической оксигенации (лечении кислородом под повышенным дав­ лением) и реперфузии, то есть возобновления кровотока после его на­ рушения из-за тромбоза (закупорки сосуда) или сильного спазма, харак­ терных для инфаркта миокарда или инсульта головного мозга; значи­ тельная выраженность воспаления с активацией нейтрофилов и макро­ фагов также неизбежно приводит к накоплению АФК; к другим факто­ рам относят избыток гема, Fe2+ и Си+ , ионизирующие и ультрафиолето­ вое излучения, курение, витамин Д, большие дозы витамина А и неко­ торые ксенобиотики.

Оксидативный стресс приводит к повреждению наиболее важных полимеров —нуклеиновых кислот, белков и липидов. Из АФК только НО' вызывает повреждения ДНК (окисление оснований, их модифика­ ции, разрывы цепей, повреждения хромосом), при этом сейчас считают, что АФК вызывают больше мутаций, чем другой класс мутагенов - ал­ килирующие вещества. Мутации могут привести к патологии и гибели

136

Г

клеток или к их злокачественному перерождению (раки, лейкозы и др.), а мутации в ДНК половых клеток - к наследуемым заболеваниям. Вы­ сокие концентрации АФК и липидных гидропероксидов ингибируют синтез ДНК и деление клеток и могут активировать апоптоз (програм­ мированную смерть клеток), что полезно для организма, так как ценой гибели части клеток предупреждается прогрессирование злокачествен­ ных процессов и гибель целого организма.

ОМ белков, вызванная АФК, не только изменяет аминокислотные остатки, но и нарушает третичную структуру и даже вызывает агрега­ цию и денатурацию белка. В результате снижается или исчезает их многообразная функциональная активность.

ПОЛ прежде всего повреждает клеточные мембраны, кроме того, продукты ПОЛ (малоновый диальдегид и др.) являются мутагенными и цитотоксичными.

Избыток некоторых эйкозаноидов также дает патологические эффекты: тромбоз и гипертонию (тромбоксаны), гиперчувствитель­ ность, участие в патогенезе бронхиальной астмы, шока, инфаркта мио­ карда, язвы желудка (лейкотриены).

Все описанные нарушения могут серьезно или полностью дезор­ ганизовать функционирование клеток и организма в целом, утяжелить или даже вызвать серьезные болезни и привести к смерти и/или наслед­ ственной патологии. Оксидативный стресс с накоплением в тканях и биологических жидкостях АФК и вторичных продуктов ОМ макромо­ лекул обнаружен при многих (>60) болезнях и патологических синдро­ мах, часто называемых свободно-радикальной патологией:

Заболевания, в возникновении которых участвуют активные фор­ мы кислорода:

-Атеросклероз: (коронарные, церебральные, ренальные, кишеч­ ные, периферические нарушения кровоснабжения).

-Сахарный диабет и диабетическая ангиопатия.

-Легочные заболевания: (хронический обструктивный бронхит, бронхиальная астма, эмфизема).

-Ревматико-воспалительные и дегенеративные заболевания сус­

тавов.

-Катаракта.

-Виды рака, возникающие из-за экзогенных факторов.

-Старость.

-Болезнь Паркинсона.

-Различные интоксикации.

Внаших клетках ежесекундно образуются АФК, но мы продолжа­ ем жить благодаря существованию системы сдерживания свободнора­ дикального окисления.

137

Антиокислительная система организма (АОС) - это система защиты организма от токсического действия кислорода.

АОС включает ферментативные и неферментативные компонен­

ты.

Ферментативные: ферменты супероксиддисмутаза, пероксидаза, каталаза.

Супероксиддисмутаза - высокоактивный фермент, присутст­ вующий во всех клетках, она инактивирует супероксидные радикалы.

0 2* + 0 2‘ + 2 Н - » Н20 2+ 0 2

Образующаяся токсичная перекись обезвреживается в дальней­ шем ферментами каталазой или пероксидазой.

Пероксидаза - сложный фермент, содержащий геминовое железо. Распространена в основном у растений, а так же в лейкоцитах, тромбо­ цитах. Для ее действия необходим дополнительный субстрат - донор водорода. В качестве такого дополнительного субстрата служат аскор­ биновая кислота, хиноны, глутатион. Рассмотрим механизм действия глутатион-пероксидазы, присутствующей в эритроцитах. Глутатионпероксидаза в качестве простетической группы содержит селен, доно­ ром водорода для обезвреживания Н20 2служит глутатион. Глутатион - это трипептид, содержащий цистеин, т.е. SH-группы: у

Глутатионпероксидаза катализирует реакцию:

Н20 2+ 2Н8~глутатион —> 2 Н20 + Г

Каталаза: 2Н20 2-> 2Н20 + 0 2 Каталаза - гемсодержащий фермент, находится в крови, костном

мозге, слизистых оболочках, печени, почках. Для обезвреживания Н20 2 не нужен дополнительный субстрат —донор водорода. В качестве доно­ ра водорода служит сам Н20 2, т.е. одна молекула Н2Огдонор водоро­ да, а вторая —разрушается.

Неферментативная система защиты

1)Витамин Е - содержится в липидной фазе мембраны. Это жи­ рорастворимый витамин. Он способен отдавать свой водород на перекисный радикал жирной кислоты, прерывая тем самым цепную реакцию перекисного окисления липидов (ПОЛ).

2)Водорастворимые соединения - аскорбиновая кислота, ураты.

3)Биорегуляторы —тироксин, стероидные гормоны.

4)Соединения с SH-группой - глутатион, цистеин.

5)Комплексоны - связывающие Fe.

138

Все антиоксиданты по механизму действия можно разделить на 2 группы:

1.Действуют на стадии инициации ПОЛ (превентивные) - ката­ лаза, пероксидаза, комплексоны.

2.Прерывают цепные реакции ПОЛ - супероксиддисмутаза, ви­

тамины С, Е, ураты.

Лекция 10

ОБЩИЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА

В результате специфических путей катаболизма углеводов, липи­ дов и аминокислот происходит сокращение числа превращающихся субстратов, и образуются только два общих промежуточных продукта - пировиноградная кислота и ацетил-КоА. Они вступают в общий путь катаболизма, который является единым продолжением специфических путей.

Кобщему пути катаболизма относят два процесса:

1.Окислительное декарбоксилирование пирувата.

2.Окисление ацетил-КоА в цикле трикарбоновых кислот. Пируват является продуктом превращения углеводов (глюкозы),

глицерина, гликогенных аминокислот. Ацетил-КоА образуется в мито­ хондриях при:

1. Окислительном декарбоксилировании пирувата.

2. р-окислении высших жирных кислот.

3. Превращении кетогенных аминокислот.

Таким образом, в общий путь катаболизма могут вступать про­ дукты специфических путей на уровне пирувата, ацетил-КоА и метабо­ литов цикла трикарбоновых кислот.

Окислительное декарбоксилирование пирувата

Образовавшаяся в цитоплазме пировиноградная кислота поступа­ ет в митохондрии, где подвергается окислительному декарбоксилированию при участии полиферментного пируватдегидрогеназного комплек­ са. Процесс протекает в матриксе митохондрий.

Комплекс включает три фермента и пять кофакторов:

139

1) Пируватдегидрогеназа с^коферментом тиаминпирофосфат.

2) ^гадрсйипоиЯтршюацетилазк с коферментами амидом липоевой кислоты и коферментом А.

3) Дигидролипоилдегидрогеназа, имеющая кофакторы ФАД и

НАД.

Все ферменты имеют субъединичное строение. Субъединицы дигидролипоилтрансацетилазы составляют ядро комплекса, вокруг кото­ рого расположены субъединицы пируватдегидрогеназы и дигидролипоилдегидрогеназы.

NH2

Тиаминпирофосфат (коферментная форма витамина Bt)

s----S

I I

сн2-сн2-сн-сн2-сн2-сн2-сн2-соон

Липоевая кислота (6,8-дитиооктановая кислота)

пантотеновая кислота

Благодаря объединению ферментов с кофакторами в комплекс промежуточные продукты быстро взаимодействуют с ними.

Пировиноградная кислота представляет молекулу, в которой элек­ тронная плотность оттягивается на кислород, в связи с чем он приобре­ тает частично отрицательный заряд, а углерод —частично положитель­ ный. Пируват взаимодействует с тиаминпирофосфатом (ТПФ) пируват-

140