Биохимия пособие Коновалова 2012

стями нуклеотидов. Этот набор может быть достаточно большим. По грубым оценкам в человеческом организме содержатся многие десятки тысяч разных белков. Это, однако, ничтожная часть от практически неисчерпаемого мыслимого числа белков. Ведь из 20 аминокислот можно построить 20x20=400 разных димеров (т.е. попарно соединен­ ных аминокислот), 20х20х20=203=8000 тримеров, а сравнительно ко­ ротких белков длиной всего в 100 аминокислотных остатков - 20100 = Ю130, что гораздо больше, чем число атомных ядер во всей доступной наблюдению части Вселенной (последнее оценивается как Ю80). Опре­ деленные характерные для данного организма белки не могут возни­ кать случайно. При образовании в живом организме (биосинтезе) бел­ ков должна существовать некоторая управляющая система, которая содержит информацию о том, какие именно последовательности ами­ нокислот нужно собирать в данном организме. Первичным материаль­ ным носителем такой информации является ДНК.

Итак, первичная структура генетически детерминирована и определяет индивидуальные свойства белков, их видовую специ­ фичность, на ее основе формируются все последующие структуры.

2. Вторичная структура

Это регулярная организация полипептидной цепи, удержи­ ваемая водородными связями между NH и СО группами пептид­ ных связей стержня цепи. Она может быть в виде а-спирали и Э- структуры. В а-спирали водородная связь возникает в пределах одной цепи между первым и пятым аминокислотными остатками и направле­ на параллельно оси молекулы. На каждый виток (шаг) спирали прихо­ дится 3,6 аминокислотных остатка, шаг спирали равен 0,54 нм.

В Э-структуре водородные связи возникают между соседними цепями (или в одной цепи), перпендикулярно оси молекулы.

Особую вторичную структуру имеет коллаген.

Не все полипептиды способны образовывать устойчивую а- спираль. Препятствуют образованию а-спирали подряд расположен­ ные глутаминовая кислота, аргинин, лизин, аспарагин, серин, треонин, лейцин. Когда в полипептидной цепи встречается пролин, а-спираль нарушается и возникает петля или изгиб, т.к. пролин не способен обра­ зовывать внутрицепочечную водородную связь.

Степень а-спнралнзации некоторых белков

21

3. Третичная структура

Это расположение полипептидной цепи в трехмерном про­ странстве. Эту структуру стабилизируют дисульфидные связи (цисцис), ионные (асп-лиз), водородные (тир-гис), гидрофобное взаимодей­ ствие (лей-вал, изо-ала). Связи образуются между боковыми ради­ калами аминокислот. В зависимости от формы третичной структуры различают глобулярные и фибрилярные белки. В глобулярных бел­ ках часто преобладает а-спираль, фибриллярные белки образуются на основе p-структуры.

В крупных белках при сворачивании полипептидной цепи часто образуются две или более пространственно разделенные области, назкваемые доменами. По своей структуре каждый домен напоминает небольшой белок. Обычно в одном домене от 40 до 300 остатков ами­ нокислот.

На поверхности глобул располагаются гидрофильные группы, внутри - гидрофобные.

Длинные белковые цепи состоят зачастую более чем из 1000 аминокислотных остатков, среди которых имеются как полярные, так и неполярные (гидрофильные и гидрофобные) радикалы. Последние предпочитают взаимодействовать не с водой, а друг с другом. В ре­ зультате этого белковые молекулы принимают компактную форму с наименьшей площадью поверхности. Этому требованию при заданном объеме отвечает сфера. Таким образом, если число гидрофильных аминокислотных остатков достаточно велико для того, чтобы покрыть поверхность сферического гидрофобного ядра, белковая молекула бу­ дет иметь сферическую (глобулярную) форму. Если их число больше минимально необходимого, глобула принимает форму эллипсоида. Ес­ ли же, напротив, гидрофильных радикалов не хватает, чтобы защитить гидрофобное ядро молекулы от водной атаки, в ней остаются незащи­ щенные участки. Такие белковые молекулы имеют тенденцию образо­ вывать надмолекулярные ассоциаты, и в дополнении ко вторичной и третичной структурам белки приобретают четвертичную структуру.

4. Четвертичная структура

Характерна для белков, состоящих из нескольких субъеди­ ниц. Это взаиморасположение субъединиц белка в пространстве. Формируют эту структуру слабые связи между комплементарными поверхностями субъединиц.

Для четвертичной структуры вводят следующую терминологию: протомер - отдельная полипептидная цепь в третичной структуре; субъединица —протомер или несколько протомеров, несущих часть функциональной активности белка; мультимер —сочетание субъеди-

22

белка, несущих полную функциональную активность.

н д ля проявления биологической активности белка необходинативная третичная, а для мультимерных белков —четвертич­

ная структура.

Олигомерные глобулярные белки, имеющие четвертичную Уйгуру, часто обладают регуляторными свойствами.

Рассмотрим, как наличие четвертичной структуры сказывается на функции. Для этого сравним два белка: миоглобин и гемоглобин.

Миоглобин - белок, сохраняющий и транспортирующий кисло­ род в мышцах. Состоит из одной полипептидной цепи (153 аминокис­ лотных остатка), свернутой в пространстве в виде плотной глобулы (третичная структура). В гидрофобном кармане располагается гем, же­ лезо в составе которого способно присоединять кислород. Кривая на­ сыщения миоглобина кислородом имеет гиперболическую форму. Эф­ фект полного насыщения кислородом наблюдается при низком значе­ нии р02 (которое имеется в мышцах).

Гемоглобин - мультимер, образованный из 4-х субъединиц двух типов - а 2[32 (четвертичная структура). Каждая из субъединиц похожа на молекулу миоглобина. Молекула гемоглобина способна присоеди­ нять 4 молекулы кислорода. При этом проявляется совместный (коо­ перативный) эффект субъединиц. При оксигенации гемоглобина свя­ зывание кислорода одной субъединицей так изменяет конформацию остальных субъединиц, что присоединение к ним кислорода облегча­ ется.

Физиологический смысл заключается в том, что при р02 меньше 35 мм рт.ст. (ткани) кислород будет связываться миоглобином. Сигмо­ идный характер оксигенации гемоглобина обеспечивает его транс­ портную функцию.

Возникает вопрос: почему многие белки состоят из субъединиц? Какие преимущества это дает по сравнению с одной длинной пептид­ ной цепью?

1)Наличие субъединичной структуры позволяет «экономить» гене­ тический материал. Для олигомерных белков, состоящих из идентич­ ных субъединиц, резко уменьшается размер структурного гена и соот­ ветственно длина матричной РНК.

2)При сравнительно небольшой величине цепей уменьшается влияние случайных ошибок, которые могут возникнуть в процессе

биосинтеза белковых молекул. Кроме того, возможна дополнительная выбраковка «неправильных», ошибочных полипептидов в процессе ас­ социации субъединиц в единый комплекс.

3) Наличие субъединичной структуры у многих белков позволяет •слетке легко регулировать их активность, например, путем смещения Равновесия ассоциация —диссоциация в ту или иную сторону.

23

4) Субъединичная структура облегчает и ускоряет процесс молеку­ лярной эволюции. Мутации, приводящие лишь к небольшим конформационным изменениям на уровне третичной структуры за счет мно­ гократного усиления этих изменений при переходе к четвертичной структуре, могут способствовать появлению у белка новых свойств.

Характерной особенностью белков с четвертичной структурой является их способность к самосборке. Легко происходит, например, самосборка гемоглобина из смеси альфа- и бета-цепей. Таким образом, в аминокислотной последовательности полипептцдных цепей олиго­ мерного белка закодированы как бы два уровня информации: один из них определяет трехмерную структуру отдельных полипептидных це­ пей, а второй, поскольку каждая субъединица содержит специфические участки связывания с другими субъединицами, определяет четвертич-

туры путем разрыва дисульфидных и слабых нековалентных связей, белок теряет свою биологическую активность. Потеря биологической активности связана с утратой неповторимой мозаики функциональных групп и радикалов на поверхности молекулы белка.

Денатурацию вызывают агенты, влияющие на заряд молекулы белка (кислоты, щелочи) гидратную оболочку (нагревание, водоотни­ мающие вещества). При денатурации первичная структура сохраня­ ется. Денатурация обратима, если после удаления денатурирующего агента восстанавливаются нативная конформация и свойства бел­ ковой молекулы.

Белки можно разделить на два основных класса: фибриллярные белки —это расположенные параллельно друг другу вытянутые полипептидные цепи, и глобулярные белки, в которых полипептидные цепи плотно свернуты в глобулы.

9. Белковая глобула —твердое тело или жидкость?

Итак, глобула сформировалась. В ней присутствуют элементы вторичной структуры, например достаточно протяженные а-спирали и p-слои, уложенные определенным образом и формирующие как бы каркас макромолекулярной структуры. Между элементами вторичной структуры определенным образом уложены неспирализованные участ­ ки полипептидной цепи, в части глобулы могут присутствовать моле­ кулы воды, гидратирующие полярные группы. Каковы общие физиче­ ские характеристики белковой глобулы? На что был бы похож матери­ ал, из которого сделана глобула, если глобулу Сложно было бы взять в руки?

Ответ на этот вопрос имеет непростую историю. Практически до

24

начала 80-х годов считалось, что белок скорее похож на органические кристаллы. В этом убеждали данные рентгеноструктурного анализа, которые показывали, что атомы в глобуле уложены очень плотно и ка- 5кдый из них, как в кристалле, четко знает свое место. Так как перио­ дичности (как в кристаллах) в расположении атомов в глобуле не на­ блюдается, то появился даже термин для описания физического со­ стояния глобулы - «апериодический кристалл».

На рисунке представлена упрощенная схема устройства белковой глобулы, которая поможет понять ее основные свойства как механиче­ ской системы. Элементы вторичной структуры образуют довольно же­ сткий спиральный каркас. Спиральный каркас окружен значительно более быстро движущимися боковыми группами. Они образуют как бы жидкоподобную «опушку» вокруг жесткого каркаса. То есть с точки зрения механики глобулу можно представить как армированную кап­ лю.

(ель армированной капли для белковой глобулы: а - относительно жесткие спиральные структуры;

b - жидкоподобные области

К.В. Шайтан, 1999

Итак, белковая глобула при обычных температурах сочетает свойства очень вязкой капельки жидкости и не очень упругого твердо­ го тела. Сочетание таких свойств оказывается весьма удачным для обеспечения функционирования белков. Упругий каркас поддерживает структуру с точностью до нескольких ангстрем, формируя группы ак­ тивного центра в конфигурации, близкой к наиболее благоприятной для осуществления функционального акта. Химические изменения, происходящие в активном центре, сопровождаются перемещениями атомов и групп на расстояния около 1 ангстрем. Жидкоподобная внутрибелковая среда, характеризуемая достаточно быстрыми временами конформационной релаксации, не является непреодолимым препятст­ вием для движений атомных групп в определенных пределах, необхо­ димых для проведения реакции. Но эта же среда будет резко тормозить перемещения атомных групп, геометрия которых не вписывается в пределы, определяемые упругими (жесткими) элементами данной бел­ ковой глобулы. Тем самым создаются физические предпосылки регу­ ляции стереоспецифичности биохимических реакций.

25

I

10.Формирование нативной структуры белка

10.1.Внутриклеточная регуляция формирования нативной пространственной структуры белков

Синтезируемые в клетке полипептидные цепи, образованные в результате последовательного соединения аминокислотных остатков, представляют собой как бы полностью развернутые белковые молеку­ лы. Для того, чтобы белок приобрел присущие ему функциональные свойства, цепь должна определенным образом свернуться в простран­ стве, сформировав функционально активную («нативную») структуру. Несмотря на громадное число теоретически возможных для отдельной аминокислотной последовательности пространственных структур, сво­ рачивание каждого белка приводит к образованию единственной на­ тивной конформации. Таким образом, должен существовать код, опре­ деляющий взаимосвязь между аминокислотной последовательностью полипептидной цепи и типом пространственной структуры, которую она образует. Выяснение этой взаимосвязи —нерешенная проблема, важность которой трудно переоценить. Действительно, в настоящее время уже понятно, каким образом закодированы аминокислотные по­ следовательности в структуре ДНК, однако принципы, определяющие формирование нативной конформации белка, все еще остаются «секре­ том жизни». Работы по изучению сворачивания белка были начаты сравнительно недавно. Накопленная информация (главным образом основанная на результатах исследований, проведенных с растворами отдельных очищенных белков) позволила заключить, что образование пространственной структуры —процесс спонтанный, не требующий ни дополнительной информации, ни источника энергии. Предполагалось, что эти положения применимы также и для сворачивания белков внут­ ри клетки. Однако, как это часто случается в биологии, последующие открытия заставили отказаться от такой логики; они показали, что в действительности дело обстоит значительно сложнее. Оказалось, что процесс сворачивания белка in vivo не может считаться ни спонтан­ ным, ни энергонезависимым. Благодаря существующей внутри клетки высоко координированной системе регуляции, полипептидная цепочка с самого момента своего «рождения», сходя с рибосомы, попадает под контроль факторов, которые, не изменяя специфического пути свора­ чивания (определяемого генетическим кодом), обеспечивают опти­ мальные условия для реализации быстрого и эффективного образова­ ния нативной пространственной структуры.

26

10.2. Образование пространственной структуры белка - процесс многостадийный

Как показали результаты рентгеноструктурного анализа белко­ вых кристаллов, пространственная (третичная) структура каждого бел­ ка характеризуется сочетанием элементов вторичной структуры (а- сПиралей, (3-тяжей), а также гибких участков полипептидной цепи, на­ зываемых петлями. Способность того или иного участка полипептид­ ной цепи образовывать элемент вторичной структуры (например, свер­ нуться в а-спираль) зависит от характера аминокислотной последова­ тельности данного отрезка цепи. Таким образом, число и расположе­ ние а-спиралей, Р-тяжей и петель по ходу полипептидной цепи раз­ лично у разных белков и определяется генетическим кодом. Этим объ­ ясняется потенциальная способность любой полипептидной цепи к спонтанному сворачиванию в уникальную третичную структуру.

Согласно современным представлениям, процесс сворачивания имеет иерархическую природу: вначале очень быстро (за миллисекун­ ды) формируются элементы вторичной структуры, служащие как бы «затравками» для образования более сложных структур (стадия 1). Второй стадией (также происходящей очень быстро) является специ­ фическая ассоциация некоторых элементов вторичной структуры с об­ разованием супервторичной структуры (это могут быть сочетания не­ скольких а-спиралей, нескольких (3-цепей либо смешанные ассоциаты •данных элементов). Следующим этапом, играющим важнейшую роль для формирования уникальной «архитектуры» белка, является образо­ вание специфических контактов между участками, значительно уда­ ленными один от другого в аминокислотной последовательности, но оказывающимися сближенными в третичной структуре. Полагают, что это, главным образом, гидрофобные взаимодействия, обусловленные сближением неполярных групп и вытеснением молекул воды, распо­ ложенных между ними. Для формирования уникальной пространст­ венной структуры каждого белка необходимо, чтобы образовалось оп­ ределенное (оптимальное в каждом случае) число таких специфиче­ ских контактов. На пути к достижению оптимального варианта воз­ можны ошибки, образование «неправильных» контактов; в этом случае происходит перебор разных вариантов структуры до тех пор, пока не будет достигнут тот единственный вариант, который соответствует Функционально активному состоянию данного белка.

На пути, ведущем от образования элементов супервторичной структуры к окончательному сворачиванию цепи в компактную глобупу. имеется промежуточная стадия (стадия 3), связанная с формирова­

27

1

нием основных элементов третичной структуры (специфического со­ четания а-спиралей, Р-тяжей, соединяющих петель) и образованием гидрофобного ядра молекулы.

Стадии

сворачивания

полипептидной цепи в нативную конформацию (1-4).

Н.К. Наградова, 1996 г.

Молекула приобретает пространственную структуру, близкую к структуре нативного белка, вместе с тем, она еще не обладает прису­ щей данному белку функциональной активностью. Это состояние, по­ лучившее название «расплавленная глобула», отличается от нативного меньшей степенью упорядоченности структуры; неполярные группы, формирующие гидрофобное ядро молекулы, «упакованы» недостаточ­ но плотно. Отсутствие ряда специфических взаимодействий приводит к изменению ориентации подвижных петель; в целом молекула более лабильна и склонна к «слипанию» с другими такими же молекулами с

28

боазованием агрегатов. Таким образом, неспецифическая агрегация (стадия 5) может уменьшать число молекул белка, находящихся на правильном пути сворачивания (стадия 4), то есть снижать эффектив­ ность этого процесса. Как показали модельные эксперименты, прове­ денные in vitro, образование «расплавленной глобулы» происходит значительно быстрее, чем ее переход в нативную структуру; реакция 4 (связанная с перебором разных конформаций) является, таким образом, самой медленной стадией процесса сворачивания.

Вероятность агрегации сильно возрастает при повышении темпе­ ратуры и концентрации белка, поэтому эффективное спонтанное сво­ рачивание полипептидной цепи происходит в разбавленных растворах и при низких температурах. Обращаясь к ситуации, имеющей место in vivo, мы должны признать, что условия, существующие в клетке, силь­ но отличаются по этим параметрам. Вместе с тем, в физиологических условиях вновь синтезируемые полипептидные цепи сворачиваются достаточно быстро и эффективно. Следовательно, в клетке должны существовать специальные механизмы регуляции процесса сворачива­ ния.

Прежде чем перейти к рассмотрению этих механизмов, отметим, что изображенная на рисунке схема описывает стадии сворачивания полипептидной цепи, кодируемой одним геном. Многие белки, однако, возникли в процессе эволюции в результате слияния разных генов; участки полипептидных цепей таких белков, кодируемые разными ге­ нами, сворачиваются независимо друг от друга, по разным путям и с разными скоростями, образуя после сворачивания глобулярные струк­ туры, называемые доменами. Формирование нативной структуры бел­ ков, состоящих из двух или более доменов, усложняется за счет допол­ нительной стадии - установления специфических контактов между доменами. Ситуация еще более усложняется, когда функционально ак­ тивна олигомерная форма белка (то есть состоящая из нескольких по­ липептидных цепей, каждая из которых после сворачивания образует так называемую субъединицу). В этих случаях добавляется еще одна стадия —установление контактов между субъединицами.

10.3. Механизмы регуляции процесса сворачивания полипептидной цепи внутри клетки

Согласно современным представлениям, клетка располагает, по крайней мере, двумя типами таких механизмов: 1) основанным на ре­ фляции скорости превращения «расплавленной глобулы» в нативную структуру (реакция 4) 2) обеспечивающим защиту частично свернутого белка от неспецифической агрегации, обозначенной на рисунке как ре­ акция 5.

29

Схематическое изображение струк­ туры «расплавленной глобулы» по сравнению со структурой нативного белка. Элементы вторичной струк­ туры представлены двумя спираль­ ными участками (цилиндры). За­ штрихованные фигуры изображают неполярные группы аминокислот­ ных остатков

Н.К. Наградова, 1996 г.

Ферменты, ускоряющие процесс сворачивания

Как уже отмечалось, стадия превращения «расплавленной глобу­ лы» в нативный белок является самой медленной, ограничивающей скорость всего процесса. Это обусловлено тем, что установление «оп­ тимального набора» специфических взаимодействий, стабилизирую­ щих нативную конформацию, связано с необходимостью структурных перестроек, происходящих относительно медленно. К их числу отно­ сится цис-транс-изомеризация пептидной связи, предшествующей ос­ татку пролина. Поскольку транс-конформация более стабильна, она преобладает во вновь синтезированной полипептидной цепи. Однако, для образования нативной структуры белка необходимо, чтобы около 7% связей, образованных остатками пролина, изомеризовались в цисконформацию. Эта реакция, приводящая к повороту цепи на 180° во­ круг C-N связи, идет чрезвычайно медленно. In vivo она ускоряется благодаря действию специального фермента - пептидил-пролил- цнс/транс-изомеразы.

Второй фермент, ускоряющий процесс сворачивания, катализи­ рует образование и изомеризацию дисульфидных связей. Он лока­ лизуется в просвете эндоплазматического ретикулума и способствует сворачиванию секретируемых клетками белков, содержащих дисульфидные мостики (например, инсулин, рибонуклеаза, иммуноглобули­ ны). Характерная особенность обоих ферментов состоит в том, что они не способны связываться с нативными белками; их субстраты имеют частично развернутую структуру, близкую к состоянию «расплавлен­ ной глобулы». Ускоряя стадии, лимитирующие скорость сворачивания, ферменты способствуют удержанию белка на правильном пути приоб­ ретения нативной структуры, снижая риск протеолитической деграда­ ции и агрегации лабильных промежуточных форм.

Специальные белки, увеличивающие эффективность

30