Биохимия пособие Коновалова 2012

диационная биохимия.

Исследования по нейрохимии, проводившиеся в институте фи­ зиологии (с 1953 г.), отделе регуляции обмена веществ (1970) Акаде­ мии Наук БССР, медицинских институтах и Белорусском государст­ венном университете, были посвящены проблемам функциональной биохимии центральной нервной системы (ЦНС) и синапсов; нейрохи­ мическим основам поведения, патологической химии ЦНС; влиянию фармакологических средств и экстремальных факторов на нервную систему и др. (А.И. Булыгин, А.С. Дмитриев и др.).

В области радиационной биохимии белорусскими учеными оп­ ределена роль гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы в меха­ низмах действия малых доз ионизирующей радиации и зависимость углеводного, энергетического и нуклеинового обмена в ЦНС от обес­ печенности организма глюкокортикоидами (Л.С. Черкасова, А.Т. Пикулев, М.Ю. Тайц, К.В. Фомиченко и др.).

Исследована реактивность липидтранспортной системы крови при действии разных доз радиации (каф. биохимии ВГМУ).

Белорусскими биохимиками особое внимание уделялось изуче­ нию биологических функции витамина В,. Инициатором этих исследо­ ваний явился заведующий кафедрой биохимии Гродненского медицин­ ского института в 1957-1967 годах Ю.М. Островский (1925-1991), ко­ торый в 1962 г. в Гродненском мединституте создал проблемную ви­ таминологическую лабораторию, в 1970 г. на её базе организовал отдел регуляции обмена веществ, ныне —институт биохимии - один из глав­ ных центров по витаминологии в Беларуси. Белорусские ученые зани­ маются исследованиями гиповитаминозов, межвитаминных взаимоот­ ношений, проблем витаминотерапии (Б.М. Барановский, В.М. Борец, Н.К. Лукашик, Н.З. Яговдик, Т.Я. Морозкина, В.В. Виноградов). Соз­ дана межведомственная программа по диагностике и предупреждению болезней витаминной недостаточности (А.Г. Мойсеенок, К.М. Беляв­ ский).

СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ

1. История изучения белков

Белки составляют основной материал клеток. В тканях млекопи­ тающих на их долю приходится 10-20%, а на долю углеводов и липи­ дов всего от 1 до 5%. Другое название белков - протеины, произошло от греческого слова «протос» —первичный.

В начале 19 века голландский химик Мульдер установил наличие азота в белках. В 1820 г. Браконно из кислотного гидролизата желати­ ны выделил первую аминокислоту - глицин. В 1871 г. Любавин уста-

12

новил, что при переваривании белков образуются аминокислоты. В 1902 г. Фишер показал, что аминокислоты в белках соединяются пептидной связью. В 20-х годах XX века Сведберг применил ультрацентрифугу для определения молекулярной массы белков. В это же время Самнер, Нортроп, Кунитц привели доказательства, что ферменты яв­ ляются белками. Последовательность аминокислот в белке впервые изучена Сенджером на примере инсулина (1955). Пространственная структура белков впервые изучена на примере гемоглобина и миоглобина Перутцем и Кендрью с помощью ренггеноструктурного анализа.

2. Роль аминокислот в организме

Белки - это биополимеры, построенные из аминокислот (АК). Все аминокислоты по значению делят на 2 группы: протеиногенные (участвуют в построении белка) и непротеиногенные или метаОолические. Протеиногенные (20 АК) в свою очередь подразделяются на ааменимые (синтезируются в организме человека) и незаменимые (не синтезируются и должны поступать с пищей). Различают 8 абсолютно незаменимых аминокислот: триптофан, валин, треонин, метионин, ли­ зин, фенилаланин, лейцин, изолейцин и 3 полузаменимых - аргинин, гистидин, тирозин.

Метаболические аминокислоты подразделяются на аминокисло­ ты, содержащие а-аминогруппу и не содержащие а-аминогруппы. Ме­ таболическими их назвали вследствие участия в обмене веществ. При­ меры метаболических аминокислот с a NH2 группой: орнитин, цитруллин, участвуют в синтезе мочевины.

Метаболические аминокислоты без a NH2 группы:

Р-аланин - входит в состав пантотеновой кислоты, кофермента А, таурин - образует парные соединения с желчными кислотами.

Аминокислоты используются как лекарственные препараты, на­ пример, сублингвальное применение препаратов глицина стимулирует физиологические механизмы адаптации, т.к. вызванное им усиление тормозных нейромедиаторных процессов в ЦНС защищает клетки от избыточного влияния катехоламинов и оказывает, таким образом, стресс-протекторное, дезинтоксикационное действие, что дает основа­ ние назначать глицин после травм головного и спинного мозга, при энцефалопатиях, неврозах и т.д.

3. Классификация аминокислот

Все аминокислоты, входящие в состав белка, являются а- амино­ кислотами, они содержат две функциональные группы - NH2 и СООН и радикал.

13

а

N H 2— с н —с о о н

I

R

Индивидуальные свойства аминокислот определяются строением радикала. По полярности радикалов все протеиногенные аминокисло­ ты делятся на 4 группы:

1.Неполярные (гидрофобные).

2.Полярные (гидрофильные) незаряженные.

3.Отрицательно заряженные (кислые).

4.Положительно заряженные (основные).

4. Классификация белков

Белки являются высокомолекулярными полипептидами. Граница между полипептидами и белками лежит в диапазоне молекулярной массы 6000-12000 дальтон. Простые белки состоят только из амино­ кислот. Белки, содержащие добавочные (простетические) группы, та­ кие как гем, производные витаминов, липиды, углеводы и металлы, на­ зываются сложными белками. Название таких белков начинается с на­ звания добавочной группы: гемпротеины, липопротеины, гликопро­ теины, металлопротеины. Белковая часть сложных белков называется апопротеин.

Белки классифицируют по растворимости, форме и размерам белковой молекулы, по функциональному признаку. Некоторые белки, представляющие интерес для медицины, классифицируются по мето­ дам их разделения и выявления.

Классификация по растворимости —была предложена в 19071908 гг., в настоящее время имеет ограниченное применение.

Альбумины —растворимы в водных растворах солей, глобулины - плохо растворимы в воде, но хорошо растворимы в солевых раство­ рителях.

Протамины —растворимы в 70-80% этаноле, но не растворимы в воде и абсолютном этаноле. Богаты аргинином.

Гистоны - растворимы в солевых растворах.

Склеропротеины - нерастворимы в воде и солевых растворах (богаты глицином, аланином, цролином).

Классификация по форме и размерам:

Глобулярные и фибриллярные белки. При этом учитывается ак­ сиальное отношение, т.р. отношение длины молекулы к ширине. У глобулярных белков аксиальное отношение меньше 10, чаще 3-4 (ин­ сулин, альбумины, глобулины, многие ферменты). У фибриллярных белков аксиальйц^/бтношение больше 10 (кератин, миозин, коллаген,

14

фибрин).

Классификации по функции: каталитические, сократительные, регуляторные и т.д.

Специальные медицинские классификации по методам вы­

деления. Например, классификация липопротеинов:

а) по подвижности в электрическом поле: а-липопротеины, (5- липо­ протеины, пре-Р-липопротеины, хиломикроны.

б) по степени осаждения при ультрацентрифугировании - липопро­ теины высокой плотности (ЛПВП), липопротеины очень низкой плот­ ности (ЛПОНП), липопротеины низкой плотности (ЛПНП).

в) по содержанию апопротеинов — апо В-содержащие и ало А- содержащие липопротеины.

5. Биологические функции белково-пептидных веществ

Главная функция белков-ферментов - катализ биохимических реакций, и только ее одной было бы достаточно, чтобы считать белки самым важным классом биорегуляторов. Как биологические катализа­ торы ферменты участвуют в тысячах превращений, происходящих в живой клетке и составляющих основу ее метаболизма. Особое значе­ ние имеют такие универсальные ферментные системы, как ДНК- и РНК-полимеразы, разнообразные аденозинтрифосфатазы (АТФазы), аденилатциклазы.

Классификация белков по функциям:

1.Ферменты (рибонуклеаза, трипсин, ДНК- и РНК-полимеразы и ДР-)-

2.Защитные белки (иммуноглобулины, комплемент, интерферон идр.).

3.Двигательные белки (актин, миозин, спектрин и др.).

4.Структурные белки (коллаген, кератин и др.).

5.Запасные белки (казеин, яичный альбумин и др.).

6.Антибиотики (неокарциностатин, актиноксантин и др.).

7.Токсины (ботулинический, дифтерийные токсины и др.).

8.Транспортные белки (гемоглобин, цитохром с, мембранная АТФаза и др.).

9.Регуляторные белки (гистоны, репрессоры, факторы инициа­ ции и др.).

10.Рецепторные белки (родопсин, холинорецептор и др.).

11.Гормоны (инсулин, гормон роста, липотропин и др.).

Биологические функции пептидов:

1.Гормоны (окситоцин, вазопрессин и др.).

2.Нейропептиды мозга (энкефалины, эндорфины, скотофобин).

3.Алкалоиды (эрготамин, пандамин и др.).

15

4.Антибиотики (грамицидины А, В, С и S, актиномицин D и ДР-).

5.Токсины и антитоксины (фаллоидин, антаманид и др.).

6.Регуляторные пептиды (рилизинг-факторы или либерины, кар-

нозин, ансерин и др.).

Недавно открыты нейропептиды мозга —энкефалины, эндорфины, пептиды памяти, сна и т.п. Установлено, что эти пептиды образу­ ются из более сложных белковых предшественников путем процессин­ га. Быстрый рост числа вновь обнаруживаемых соединений такого ти­ па свидетельствует о важности химических механизмов в регуляции поведения и высшей нервной деятельности.

Наиболее мощные из известных токсинов являются белками мик­ робного происхождения. По уровню токсичности не имеют себе рав­ ных ботулинический, столбнячный и дифтерийный токсины и ряд эн­ теротоксинов.

6. Молекулярная масса белков, методы ее определения

Наиболее важной характеристикой белка является его молеку­ лярная масса, она колеблется в широких пределах.

Молекулярная масса белков

Известны следующие методы определения молекулярной массы:

1.Химический метод требует точного знания количественного содержания одной из аминокислот. Применение ограничено.

2.Электронная микроскопия —позволяет наблюдать отдельные молекулы белка. Навеска белка окрашивается осмиевой кислотой (мо­ лекулы черного цвета) и просматривается в электронном микроскопе. Подсчитывают число частиц и делят навеску на их число, т.е. находят массу одной молекулы. Применение ограничено.

3.Метод улътрацентрифугирования. В пробирке ультрацентри­ фуги создается центробежное ускорение, превышающее земное в сот­ ни тысяч раз. По мере перемещения молекул белка от центра к пери­ ферии пробирки образуется граница раздела белок —растворитель, ко-

16

торая регистрируется. Регистрация основана на способности растворов белка преломлять луч света, т.е. специальная оптическая система на­ правляет луч света на раствор белка и записывается граница раздела в виде пика. По перемещению этой границы можно определить расстоя­ ние, пройденное молекулой белка ко дну пробирки. Определяют кон­ станту седиментации (осаждения) белка S, которая зависит от массы и формы белковой молекулы:

ю - угловая скорость ротора, г —расстояние от центра ротора до сере­ дины пробирки с раствором белка.

Величина молекулярной массы вычисляется далее по уравнению

р- плотность растворителя.

4.Гелъфитрация и диск-электрофорез в полиакриламидном геле получили наибольшее распространение.

Для определения молекулярной массы белка производят калиб­ ровку хромотографической колонки. Колонку заполняют набухшими гранулами сефадекса. Сефадекс —это полимерные молекулы полисаха­ рида, сшитые через определенные промежутки поперечными мостика­ ми и свернутые в гранулы. Каждая гранула имеет поры.

На поверхность набухшего сефадекса помещают смесь белков с известной молекулярной массой и сверху льют растворитель. Белки с током растворителя будут проходить через колонку - элюироваться - и покидать ее с определенным объе­ мом растворителя - элюционным объемом. Белки с большой молеку­ лярной массой выйдут из колонки первыми с наименьшим элюцион­ ным объемом, т.к. они не смогут по­ пасть внутрь гранул. Мелкие моле­ кулы белков будут через поры захо-

17

дать во все гранулы, поэтому они покинут колонку самыми последни­ ми, с наибольшим элюционным объемом. Следовательно, между моле­ кулярной массой и элюционньм объемом есть зависимость. Строят ка­ либровочный график зависимости Lg молекулярной массы от злюционного объема. Затем через калибровочную колонку пропускают белок с неизвестной массой и измеряют объем элюата (Van*). И далее по графику находят М.М.

Аналогичный принцип положен в основу метода определения молекулярной массы при электрофорезе в полиакриламидном геле. Здесь сравнивают электрофоретическую подвижность неизвестного белка с электрофоретической подвижностью стандартных (калибро­ вочных) белков.

7. Физико-химические свойства белков

Белки образуют коллоидные растворы, поскольку размеры час­ тиц находятся в пределах 0,1-0,001 мкм. Для коллоидных растворов характерны следующие свойства:

1)Низкое осмотическое давление.

2)Высокая вязкость.

3)Незначительная способность к диффузии.

Вклинической биохимии используют три свойства коллоидных растворов белков - 1) способность растворов белка рассеивать луч све­ та - конус Тиндаля, это явление используется для количественного оп­ ределения белка методом нефелометрии; 2) способность растворов белка преломлять луч света —также для количественного определения белка методом рефрактометрии; 3) молекулы белка не способны про­ ходить через полупроницаемую мембрану, это используется для очи­ стки растворов белка от низкомолекулярных примесей методом диали­ за.

Белковые молекулы в растворе способны к ионизации за счет аминных и карбоксильных групп радикалов 3 и 4 групп аминокислот, а также концевых NH2 и СООН групп всех аминокислот. Благодаря на­ личию этих групп белки обладают амфотерными свойствами. В зави­ симости от аминокислотного состава различают нейтральные белки - количество NH2 и СООН групп равно, при рН=7 такие белки не имеют заряда. Но, учитывая более высокую ионизацию СООН" групп чем аминогрупп, такие нейтральные белки имеют слабый отрицательный заряд. И таких белков - большинство.

Если в составе белка преобладают аминокислоты 3 группы, т.е. отрицательно заряженные, то общий заряд белковой молекулы при рН=7 будет отрицательным, это кислые белки. При преобладании в со­ ставе белка аминокислот 4-ой группы, т.е. положительно заряженных,

18

обший заряд белковой молекулы будет положительным - основные

Для клинической биохимии имеет значение возможность снятия ояда с белковой молекулы, т.е. перевода ее в изоэлектрическое со­ стояние (ИЭС). ИЭС —это состояние белка, когда он электронейтрален. Перевести белок в ИЭС можно, изменяя pH среды. То значе­ ние pH, когда заряд белковой молекулы равен нулю, называют изоэлектрической точкой (ИЭТ). Для нейтральных белков ИЭТ ледатг в слабокислой среде, рН<7, т.е. к такому белку нужно добавить немного кислоты (Н+), чтобы нейтрализовать незначительный отрица­

тельный заряд.

Отсюда ИЭТ кислых белков лежит в кислой среде, рН<7, ос­ новных - в щелочной, рН>7 —т.к. нужно добавлять ОНдля нейтра­ лизации их положительного заряда.

Вокруг заряженных групп будут собираться диполи воды, фор­ мируя гидратную оболочку. Отсюда факторами устойчивости белка в растворе являются 1) наличие заряда и 2) наличие гидратной оболоч­ ки. Поэтому, чтобы осадить белок, т.е. перевести его в нерастворенное состояние, нужно воздействовать на эти факторы. Снятие заряда осу­ ществляется путем подведения pH к ИЭТ. Снятие гидратной оболочки осуществляется:

1)Водоотнимающими средствами —соли щелочных металлов в вы­ соких концентрациях (например, сернокислый аммоний), спирт, аце-

2)При денатурации белка - т.е. при разрушении всех пространст­ венных структур.

При осаждении белков солями щелочноземельных металлов бел­ ки не подвергаются глубоким изменениям и могут быть растворены, если убрать соли (например, диализом). Такой метод осаждения белков называют высаливанием.

Реакции осаждения белков используют в медицине для выделе­ ния и обнаружения белка в биологических жидкостях —крови, моче.

8. Уровни структурной организации белков

Выделяют 4 уровня:

1. Первичная структура

Это строго определенная линейная последовательность ами­ нокислот, соединенных между собой пептидными связями. Пеп­ тидная связь прочная, ковалентная, занимает промежуточное положе­ ние между одинарной и двойной связью. Разрушить пептидную связь монсно гидролизом. Различают кислотный, щелочной и ферментатив-

19