14. Понятие о биотехнологии и генной инженерии

Биотехнология (от греческого bios – жизнь, tecen – искусство, logos – наука) – это наука, которая на основе изучения биологических процессов в живых организмах, использует эти процессы и организмы (бактерии, вирусы, грибы и т. д.) для получения ценных для человека продуктов и материалов. Биотехнология тесно связана с производством и с ее помощью в медицине получают антибиотики, витамины, ферменты, алкалоиды, нуклеиновые кислоты, липиды, противогистаминные, противоопухолевые препараты, в ветеринарии – кормовой белок, кормовые антибиотики, витамины, гормоны, вакцины, в химической промышленности – ацетон, этилен, бутанол, в пищевой – аминокислоты, пищевые белки, ферменты, липиды, сахара, кислоты, дрожжи, в энергетике – биогаз, этанол.

Генетика микроорганизмов явилась основой для становления и развития одной из областей биотехнологии – генной инженерии. Генная инженерия связана с конструированием клеток с новыми генетическими свойствами. По своей сущности она сводится к генетической рекомбинации, т. е. получению новых рекомбинантных молекул ДНК с заданной генетической информацией. Процесс получения рекомбинантных ДНК состоит из нескольких последовательных стадий. Первая стадия сводится к выделению необходимой экспериментатору ДНК из клеток интересующего организма. Затем получают рекомбинантную (гибридную) ДНК путем встройки в геном клетки гена или группы генов, кодирующих требуемый белок (гормон, фермент и др.). после этого, рекомбинантную ДНК вводят в живую клетку (животную, растительную, микробную), которая является своего рода биофабрикой, синтезирующей большое количество различных соединений. Наконец, получают клон клеток, обладающих нужными признаками, его размножают, создают условия для максимального проявления синтезирующей способности клонированных клеток и выделяют необходимый продукт.

Опыты по генной инженерии.

Для получения разнообразных белков эукариот и вирусов животных широко применяются бактерии и дрожжи Saccharomyces cerevisiae.

При этом используются самые разные методы, но наиболее широко те из них, которые описаны ниже.

Прежде всего необходимо изолировать нужный ген. Если ген животного должен экспрессироваться в клетках бактерий или дрожжей, то обычно вначале выделяют соответствующую м-РНК. Как правило, осуществить прямую экспрессию генов животных в бактериальных клетках не удается, поскольку эти гены содержат интроны.

Некоторые гены животных, например, кодирующие а-лейкоцитарные интерфероны, не содержат интронов и могут прямо экспрессироваться в бактериальных и дрожжевых клетках. Если в качестве исходного объекта приходится использовать м-РНК, то прежде всего следует найти ее источник – ткань, в которой этот продукт образуется в наибольшем количестве. Иногда таким источником служат опухолевые ткани или же клетки в культуре, образующие необходимую м-РНК.

После транскрипции данной м-РНК и получения комплементарной ДНК (к-ДНК) необходимо определить, какие из множества молекул этой к-ДНК ген, подлежащий выделению из экспрессии. На этом этапе работы молекулы к-ДНК обычно вводят в состав плазмид или генома бактериофагов, которые служат векторами. Затем рекомбинантные плазмиды со встроенными молекулами к-ДНК переносят в клетки находящихся бактерий-хозяев.

Включение ДНК в плазмидные и фаговые векторы.

Обычно выбор вектора определяется штаммом хозяина, который используется для экспрессии клонированной ДНК. Если в роли хозяина выступает Е. coli, плазмидный вектор скорее всего представляет собой производное рВР322, а если хозяином является Bacillus spp., то векторные плазмиды получают из различных видов Bacillus или Staphylococcus. Вектор для Saccharomyces cereuisiae конструируют либо на основе плазмиды длиной 2 мкм, либо из фрагментов хромосом дрожжей, способных реплицироваться подобно плазмидам. Нередко используются челночные векторы, которые могут реплицироваться в одном или нескольких организмах-хозяевах. Применение таких векторов оказывается весьма перспективным в связи с тем, что нередко для наработки большого количества плазмид и для трансформации ДНК удобнее в роли хозяина использовать E. сoli.

Обычный метод клонирования ДНК основан на расщеплении плазмидной и встраиваемой ДНК одной и той же рестриктазой. При этом получаются молекулы с липкими концами, которые затем отжигают, получают кольцевую рекомбинантную молекулу и сшивают ДНК-лигазой фага Т4. в случае плазмиды рВР322 встраивание обычно осуществляют по генам устойчивости к антибиотикам, поскольку такие рекомбинантные молекулы легко распознать по их неспособности обеспечивать устойчивость.

ДНК-лигазу фага Т4 можно применять и для сшивания “тупых” концов молекул ДНК, хотя этот процесс осуществляется труднее, чем в случае липких концов.

Експрессия клонированных генов.

С помощью бактерий были получены с высоким выходом некоторые белки – продукты генов животных и их вирусов. Так, были созданы штамы E. сoli, у которых 20% всего белка составляли корковый антиген вируса гепатита В, гормон роста человека или главный капсидный антиген вируса ящура. У одного из конструируемых штаммов B. Subtilis, антиген составлял около 1% синтезируемого этой бактерией белка. Однако добиться экспрессии в бактериальных клетках генов некоторых белков животных или их вирусов совсем не просто, даже если эти гены сопряжены с сигналами инициации транпкрипции и трансляции, которые обеспечивают в норме высокий уровень экспрессии генов прокариот.

Литература.

1. Браун В. Генетика бактерий. М., 1968

2. Пехов А.П. Генетика микроорганизмов. М, 1977

3. Брода Э. Эволюция биоэнергетических процессов. М., 1978

4. Иванова О. А. Генетика. М., 1974

5. Дубинин Н.П. Общая генетика. М., 1970

6. Петухов В.Л., Жигачев АИ., Назарова Г.А.. Ветеринарная генетика с основами вариационной статистики. М., 1985

7. Малахов А.Г., Вишняков СИ. Биохимия сельскохозяйственных животных. М, 1984

8. Кемп П., Арме К. Введение в биологию. М., 1988

9. Льюин Б. Гены. М., 1987

10. Яблоков А.В., Юсуфов А.Г. Эволюционное учение. М., 1989

11. Гринн Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология. М., 1990

12. Воробьев А.А., Быков А.С. Микробиология и иммунология. М., 1999

13. Радчук Н. А., Дунаев Г.В. Ветеринарная микробиология и иммунология. М., 1991

14. Новиков Д.К., Генералов ИИ. Медицинская микробиология. Витебск, 2002

15. Общая микробиология и иммунология. Солонеко А.А., Гласкович А.А. Минск, 2002

16. Галактионов ВТ. Иммунология. М., 2000

Учебное издание

Медведев Александр Петрович,

Вербицкий Анатолий Анатольевич,

Шапиро Юлий Иосифович

Генетика микроорганизмов

учебно-методическое пособие для студентов факультета ветеринар­ной медицины и слушателей ФПК

Ответственный за выпуск А.А. Вербицкий

Оригинал сверстан и отпечатан в УО «Витебская ордена «Знак По­чета» государственная академия ветеринарной медицины»

Подписано в печать 29.06.2004 г. Формат 60x90 1\16. Бумага писчая. Усл. п. л. 3,1. Тираж 100 экз. заказ № 464

210026, г. Витебск, ул. 1-ая Доватора 7\11.

Отпечатано на ризографе УО ВГАВМ. Лицензия № 02330 \ 0133019 от 30.04.2004 г.