- •Московский государственный университет
- •История исследования плазмид.
- •Идентификация плазмид. Идентификация на генетическом уровне.
- •Идентификация на молекулярном уровне.
- •Распространение плазмид.
- •Классификация плазмид.
- •Поверхностное исключение и летальный зигозиз.
- •Несовместимость и группы несовместимости.
- •Молекулярная и генетическая организация плазмид.
- •Молекулярная организация.
- •Генетическая организация факторов переноса.
- •Генетическая организация конъюгативных коинтегративных плазмид.
- •Генетическая организация неконъюгационных плазмид.
- •Поддержание в клетках.
- •Репликация. Базовый репликон.
- •Распределение между клетками в процессе деления.
- •Генетическая регуляция.
- •Конъюгационный перенос.
- •Свойства бактерий, контролируемые плазмидами. Плазмиды лекарственной резистентности. Общая характеристика и механизмы действия.
- •Мутации внехромосомных факторов резистентности.
- •Элиминация r-факторов.
- •Лекарственная конверсия.
- •Продление чувствительности к лекарствам.
- •Плазмиды бактериоциногении.
- •Плазмиды и патогенность бактерий.
- •Атрибуты патогенности.
- •Плазмиды и патогенность e. Coli.
Распределение между клетками в процессе деления.
Система распределения существует независимо от генетических структур, контролирующих репликацию. Ее существование подтверждается идентификацией плазмидных мутаций в виде делеций района par, которые прекращают распределение плазмид между дочерними клетками, но не влияют на количество их копий в родительской клетке, т.е. не влияют на копийность.
Как показывают исследования, район par минирепликона плазмиды F имеет длину порядка 3000 нуклеотидов и содержит 2 кодирующие последовательности parA и parB, а так же parC, детерминирующий синтез плазмидной центромеры. Сходная
структура характерна для многих плазмид. Последовательности parA и parB кодируют белки, обладающие саморегуляцией на стадии транскрипции (так как их сверхпродукция привела бы к блокированию распределения). По одной из теорий предполагается, что после репликации плазмиды белки par связываются с сайтами распределения плазмид, в результате чего образуются комплексы узнавания. Последние формируют специфические димеры, которые связываются с одним из клеточных сайтов. Когда клетки делятся, то делятся и димеры, в результате чего, плазмидные копии поступают в новую генерацию клеток.
Генетическая регуляция.
Внешнее проявление поддержания плазмид в клетках заключается в том, что большинство или все клетки плазмидосодержащей популяции содержат плазмиды. В случае F, RI и RK2 установлено, что они кодируют летальность клеток, потерявших плазмиду, т.к. продукты соответствующих плазмидных убивают клетки, потерявшие их.
Некоторые плазмиды поддерживаются в клетках в количестве 1 – 3 копий на клетку. Они нуждаются для репликации в ДНК-полимеразеIII и их репликация проходит под строгим контролем клетки. Другие – в количестве 40–50 копий и используют ДНК-полимеразу I.
Их репликация проходит под релаксированным контролем. При делении клетки, дочерние получают не менее 1 копии плазмиды. Так как считалось, что они реплицируются на определенной стадии репликации ДНК бактерии, то, вероятно, существуют контрольные механизмы. Было предположено, что плазмиды сами регулируют свою репликацию и распределение, причем система репликации реализуется путем осуществления двух функций, одна и которых определяет среднее количество копий на клетку, а другая отзывается на изменение количества и восстанавливает его до нормы.
Еще в 60-е гг. была предложена гипотеза позитивного контроля. Предполагалось, что плазмида Fнесет 2 генных локуса, контролирующих процесс. Репликаторный локус (оператор репликации, репликатор) и структурный ген для синтеза диффузабельной субстанции – позитивного инициатора (эффектора) репликации. Контроль синтеза инициатора модулирует частоту инициации. Для объяснения стойкого наследования клетками плазмидыFв рамках этой модели было предположено так же, что она прикрепляется к тому сайту на клеточной мембране, к которому прикрепляется хромосома. В процессе каждого деления клетки происходит удвоение и мембранного сайта, и хромосомы и плазмидной ДНК. Оба образовавшихся комплекса расходятся в дочерние клетки.
В интегрированном в хромосому клетки хозяина состоянии, плазмида теряет самостоятельность репликации, которая теперь происходит вместе с хромосомой хозяина.
В 60-е гг. была выдвинута так же гипотеза негативного контроля. В соответствии с этой теорией было предположено существование негативно действую-щего стойкого ингибитора инициации репликации. Ингибитор кодируется геном, транскрибируемом немедленно после инициации репликации и каждое инициаторное событие сопровождается продукцией ингибитора в количестве, достаточном для подавления любой последующей инициации до момента, когда концентрация ингибитора уменьшится вдвое в связи с делением клетки.
В случае плазмиды colE1, установлено, что ингибитор – нестойкие нетранслируемые молекулы РНКI, которые негативно контролируют образование гибридов РНК-прозатравка – ДНК, т.к. связывается с молекулами прозатравки. В норме молекула РНК-прозатравки соединяется с ее ДНК-шаблоном в районеO-пункта, далее РНК-аза «плавит» прозатравку, давая начало РНК-затравке, на которую потом добавляется дезоксирибонуклотиды. Комплекс же РНКI-РНК-прозатрав-ка выключается из процесса.
Определенное влияние оказывает клетка хозяина. Многие плазмиды для репликации нуждаются в бактериальных ДНК-полимеразах. Репликация плазмиды pRSF2124 нуждается в бактериальных эндонуклеазах, контролируемых генами бактериальной хромосомы.
На количество копий плазмид оказывают влияние вид бактерий, хромосомные гены, культивирование бактерий. Например копийность плазмид pER2 вE.coliвыше нежели чем в коринобактериях.
Экспериментальные данные свидетельствуют, что и в контроле распределения участвуют гены хромосомы хозяина.