Идентификация плазмид. Идентификация на генетическом уровне.

Этот метод идентификации основан на учете фенотипов исследуемых бактерий (свежих изолятов) по сравнению с фенотипами известных штаммов, а так же на последующем установлении трансферабельности интересующего свойства к другим бактериям.

Что бы проверить, детерминируется ли отличающий признак плазмидой, прибегают к конъюгационным скрещиваниям резистентных клеток (доноры) с чувствительными клетками (акцепторы). Положительный результат в форме наблюдения конъюгации и селекции резистентных трансконъюгантов означает, что лекарственная устойчивость в исследуемом случае трансмиссивная.

При получении отрицательных результатов, сначала делают предположение, что признак контролируется неконъюгативной плазмидой. В этом случае пытаются провести мобилизацию на перенос исследуемую плазмиду известной конъюгативной плазмидой.

Если и этот тест не дал положительных результатов, то предполагают, что возможно, по каким-то причинам, плазмида оказалась недоступной для мобилизации. Вопрос о плазмидной резистентности в данном случае решают в зависимости от результатов экспериментов по трансдукции.

Установление плазмидной резистентности должно сопровождаться исключением резистентности, контролируемой транспозируемыми генетическими элементами (транспозонами).

В тех случаях, когда исследуемый признак легко обнаруживается при изучении отдельных колоний, дополнительную информацию может дать изучение стабильности плазмид. При этом исследуют как спонтанную элиминацию плазмид (следствие ошибок репликации или распределения между дочерними клетками плазмидных копий, что с трудом поддается математическому учету), так и индуцированную. К индуцированной элиминации прибегают тогда, когда спонтанная элиминация происходит с чрезвычайно низкой частотой. Обычно используют акридин оранжевый или этидий бромид. Универсального элиминационного химического агента к настоящему времени не найдено, поэтому обычно прибегают к комбинированной обработке различными химическими веществами.

Если резистентность детерминируется хромосомно, то мутация, сопровождающаяся утерей признака, может ошибочно указать на плазмидный контроль признака. В этом случае прибегают к индукции обратных мутаций, что позволит исключить ложное предположение.

Для идентификации F-подобных факторов генетического переноса прибегают к использованию реакции нарастания титра F-дононорспецифических фагов (РНТФ) в культурах исследуемы бактерий, которые не имеют видимых свойств, указывающих на содержание в них плазмид. Положительная РНТФ указывает на присутствие в клетках фактора переноса.

Значительно сложнее осуществлять идентификацию и определение типовой принадлежности плазмид в бактериальной клетке, которые могут содержать комплексы плазмид, состоящие из нескольких плазмид разных типов, включая F-факторы. В таких случаях прибегают к «разгонке» плазмид с помощью скрещиваний или физических методов с последующей генетической характеристикой каждой плазмиды.

Идентификация на молекулярном уровне.

Идентификация плазмид в этом случае производится путем выделения, очистки и характеристики плазмидной ДНК, количество которой в плазмидосодержащих клетках составляет около 5% тотальной ДНК клетки.

Основная сложность в выделении ДНК плазмид – отделение от хромосомной ДНК.

Это достигается с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия.

В исследованиях используют метод электрофореза, с помощью ферментов-рестриктаз получают физические карты плазмид. Молекулярная масса ДНК плазмиды определяется с помощью определения контурной длины молекулы используя электронную микроскопию.