3.3.9. Cинтез рнк

В клетках организмов синтез рибосомной, матричной и транспортной РНК представляет собой первый этап внутриклеточной реализации генетической информации, закодированной в молекулах ДНК, он получил название транскрипции. В ходе этого процесса под действием ферментов РНК-полимераз осуществляется копирование определённых участков нуклеотидных последовательностей ДНК в виде синтезируемых рибонуклеотидных цепей РНК, которые комплементарны ДНК-матрице. При синтезе РНК принцип комплементарности оснований реализуется путём спаривания аденина с урацилом (А∙∙∙∙У) и гуанина с цитозином (Г∙∙∙∙Ц). В качестве матрицы для синтеза РНК служит одна из цепей двойной спирали ДНК, которую называют значащей цепью.

Построение полинуклеотидной цепи РНК происходит в результате присоединения к свободным 3'-концам синтезирующейся молекулы РНК 5'-фосфатных групп комплементарных ДНК-матрице остатков рибонуклеотидов, источниками которых в процессе синтеза служат соответствующие рибонуклеозидтрифосфаты. В ходе реакции происходит гидролиз макроэргической связи рибонуклеозидтрифосфата, присоединение рибонуклеотидного остатка 3'-ОН синтезируемой молекулы РНК и высвобождение свободного пирофосфата – Н₄Р₂О₇. При этом у первого нуклеотидного остатка синтезированной цепи РНК на 5'-конце остаётся трифосфатная группировка. Чаще всего инициаторными рибонуклеозидтрифосфатами при синтезе РНК служат АТФ или ГТФ, с 3'-ОН которых далее взаимодействует следующий рибонуклеозидтрифосфат. Образование фосфодиэ фирных связей в ходе синтеза РНК можно представить в виде следующей схемы:

Синтез РНК начинается с того, что фермент РНК-полимераза присоединяется к определённому участку значащей цепи ДНК, называемому промотором, и, перемещаясь по этой цепи, катализирует образование на ДНК-матрице полирибонуклеотидной цепи РНК. Синтез РНК заканчивается на участке ДНК, называемом терминаторным. Нуклеотидная последовательность ДНК, начинающаяся промотором и заканчивающаяся терминатором, является структурной единицей транскрипции и получила название транскриптона. У бактерий транскриптоны называют оперонами. Они обычно включают по нескольку генов, которые кодируют функционально связанные полипептиды. У высших организмов транскриптоны, как правило, включают по одному гену.

В ядрах клеток высших организмов найдены три вида РНК-полиме-раз – I, II и III. РНК-полимераза I катализирует синтез в ядрышке 18S и 28S рибосомной РНК, РНК-полимераза II – синтез мРНК, РНК-полимераза III – синтез тРНК и других низкомолекулярных форм РНК. В каждой молекуле ядерных РНК-полимераз содержатся две большие субъединицы с молекулярными массами 120–220 тыс. и 5–13 малых субъединиц с молекулярными массами 10–100 тыс. Кроме того, в клетках высших организмов синтезируются хлоропластные и митохондриальные РНК-полимеразы. По строе-нию молекул хлоропластные РНК-полимеразы сходны с аналогичными ферментами бактерий. Митохондриальные РНК-полимеразы отличаются по строению молекул и от ядерных, и от бактериальных РНК-полимераз, но они имеют значительное сходство с РНК-полимеразами некоторых бактериофагов.

Процесс транскрипции начинается с присоединения фермента РНК-полимеразы к промотору, который представляет собой участок двойной спирали ДНК в самом начале транскриптона. Размер промотора определяется размером молекулы РНК-полимеразы, у бактерий он обычно составляет по длине 70–75, а у высших организмов 200–300 нуклеотидных остатков. Присоединяясь к промотору, РНК-полимераза образует комплекс с ДНК, в котором под действием ферментного белка происходит расплетание одного витка двойной спирали ДНК в той части промотора, где находится инициаторный нуклеотидный остаток, дающий начало синтезу рибонуклеотидной цепи РНК. К инициаторному нуклеотидному остатку ДНК комплементарно присоединяется молекула АТФ или ГТФ и далее уже к их 3'-ОН присоединяется следующий нуклеотидный остаток синтезируемой цепи РНК.

Инициаторный нуклеотидный остаток ДНК, дающий начало транскрипции, находится в составе промотора на расстоянии примерно 20–25 нуклеотидных остатков от его внешней границы, направленной по ходу транскрипции. В каждом промоторе содержится определённый набор участков со специфическими последовательностями нуклеотидных остатков, который «узнают» ферменты РНК-полимеразы, и только тогда они образуют с промоторами достаточно прочные комплексы, способные к инициации транскрипции.

Стадия инициации трансурипции заканчивается при образовании за-

чатка нуклеотидной цепи РНК длиной до 3–6 нуклеотидных остатков (в зависимости от типа промотора), который образует со значащей цепью ДНК гибридную спираль и таким образом достаточно прочно удерживается в комплексе фермента с ДНК. Как только заканчивается стадия инициации транскрипции, процесс транскрипции переходит в следующую стадию – стадию элонгации синтезирующейся цепи РНК.

В ходе синтеза рибонуклеиновой кислоты РНК-полимераза движется по матрице в направлении от 3'-конца к 5'-концу значащей цепи ДНК, расплетая двойную спираль. В активном центре фермента осуществляется присоединение рибонуклеотидных остатков к растущей цепи РНК и удерживается гибридный участок двойной спирали ДНК–РНК длиной примерно 12 нуклеотидных остатков. Позади фермента восстанавливается двойная спираль ДНК и одновременно из каталитического центра фермента высвобождается участок синтезируемой цепи РНК (рис. 3.12).

С интез РНК заканчивается при достижении РНК-полимеразой участка ДНК, называемого терминатором. Изучение процесса терминации тран-скрипции генов у высших организмов с участием РНК-полимеразы II показало, что на 3'-концах синтезируемых полинуклеотидных цепей мРНК имеется специфическая последовательность ААУААА, которая предшествует 3'-концевой последовательности поли-А и во время синтеза является специфическим сигналом к полиаденилированию 3'-конца мРНК.

Рис. 3.12. Синтез РНК на ДНК-матрице с участием фермента РНК-полимеразы

1 – РНК-полимераза; 2 – синтезируемая цепь РНК; 3 – гибридный участок двойной спирали ДНК – РНК. Стрелкой показано направление движения РНК-полимеразы.

Синтез РНК является первым этапом реализации в организме генетической информации, который далее инициирует синтез белков и прежде всего белков-ферментов, катализирующих ту или иную жизненно важную биохимическую реакцию. Если в конкретных физиологических условиях потребности в данном ферменте нет, то и нет необходимости организму осуществлять синтез соответствующей мРНК. Поэтому синтез многих мРНК в клетках организмов подвержен регуляции, которая осуществляется как на стадии инициации, так и в процессе транскрипции.

На стадии инициации транскрипции регуляторное воздействие оказывают специфические белки, которые, присоединяясь к определённым участкам ДНК, останавливают или, наоборот, активируют действие фермента РНК-полимеразы. Белки-регуляторы, подавляющие действие РНК-полимеразы, называют репрессорами, а усиливающие действие этого фермента – активаторами транскрипции. Участок ДНК, с которым связывается белок-регулятор, у бактерий называют оператором, у высших организмов – регуляторным элементом гена. Способность регуляторных белков связываться с ДНК зависит от низкомолекулярных веществ – эффекторов. Эффекторы, соединяясь с регуляторными белками, вызывают аллостерическое изменение их структуры, вследствие чего изменяется сродство белка-регулятора к регуляторному участку ДНК.

Различают два вида белков–репрессоров транскрипции. Одни из них оказывают репрессирующее действие на промоторы в отсутствие эффектора, а при взаимодействии с эффектором теряют сродство к своему регуляторному участку и таким образом инициируют процесс транскрипции. Белки-репрессоры второго типа способны присоединяться к ДНК и ингибировать транскрипцию только в комплексе с эффектором. В отсутствии эффектора белок-репрессор неактивен, и в таких условиях РНК-поли-мераза может взаимодействовать с промотором и осуществлять синтез мРНК.

Наиболее эффективный механизм репрессии транскрипции реализу-

ется в том случае, когда участок связывания белка-репрессора находится на промоторе. Присоединившись к определённому участку промотора, репрессорный белок препятствует присоединению к промотору РНК-полиме-разы. Действие белков – активаторов транскрипции – очень часто заключается в том, что такой белок присоединяется к регуляторному участку ДНК, непосредственно прилегающему к промотору, и, взаимодействуя с РНК-полимеразой, переводит этот фермент в активное состояние.

У высших организмов регуляция транскрипции генов включает регуляторные последовательности, которые локализованы в промоторах, в составе нуклеотидных последовательностей между промотором и структурным геном, а также внутри структурных генов в составе интронов – участков ДНК, не кодирующих полипептиды. К указанным регуляторным последовательностям присоединяются специфические белки, которые, вза-имодействуя с РНК-полимеразой, активируют действие этого фермента или, наоборот, прекращают транскрипцию.

Транскрипция генов мРНК растений и других высших организмов, катализируемая РНК-полимеразой II, начинается на ДНК с инициаторной последовательности нуклеотидных остатков ТЦ(А,Г)А. Кроме того, в промоторной зоне обычно находятся повторяющиеся элементы так называемых активирующих последовательностей, к которым присоединяются регуляторные белки, инициирующие действие фермента РНК-полимеразы II.

Транскриптоны генов рибосомальных РНК имеют свои особенности функционирования. Многократно повторяющиеся нуклеотидные последовательности этих генов локализованы в ядрышке, и их транскрипцию катализирует фермент РНК-полимераза I. Гены рРНК разделены некодирующими участками – спейсерами, в которых содержатся повторяющиеся последовательности нуклеотидных остатков, активирующие транскрипцию. В конце спейсера находится терминаторная последовательность нуклеотидных остатков, которая осуществляет терминацию транскрипции, но при этом РНК-полимераза I не отделяется от ДНК. К ферменту присоединяется новая регуляторная субъединица и он продолжает транскрипцию следующего участка гена рРНК.

Транскрипцию генов 5S-РНК и тРНК катализирует фермент РНК-полимераза III. Поскольку эти гены имеют небольшие нуклеотидные последовательности, их промоторы не выделяются в отдельные участки, а находятся непосредственно в структуре генов. Инициация транскрипции осуществляется с помощью регуляторных белков, которые присоединяются к определённому участку ДНК в составе гена и активируют фермент РНК-полимеразу III. Терминаторный участок таких генов включает несколько повторяющихся остатков тимидиловых нуклеотидов.

Синтезированные в ходе транскрипции молекулы всех видов РНК подвергаются направленному воздействию ряда ферментов, которые осуществляют превращение РНК-предшественников в функционально активные молекулы РНК, способные выполнять свойственные им биологические функции. Превращение РНК-транскриптов в функционально активные молекулы РНК получило название процессинга. В клетках высших организмов процессинг РНК происходит в ядре.

Образующиеся в ходе транскрипции ядерные предшественники мРНК связываются с ядерными белками, формируя рибонуклеопротеидные комплексы, которые далее включаются в процессинг. Особенность процессинга у эукариот заключается в том, что их мРНК-транскрипты состоят из участков, которые входят в состав функционально активных (зрелых) мРНК, и участков, подлежащих удалению в результате процессинга. Участки мРНК-транскрипта, входящие в состав зрелых мРНК, называют экзонами, а удаляемые в ходе процессинга фрагменты мРНК-транскрипта – интронами. Таким образом, гены высших организмов представляют собой определённую последовательность чередующихся экзонов и интронов (рис. 3.13).

Экзоны включают участки мРНК-транскриптов, кодирующие первичную структуру полипептидов, участки на 5'-конце, содержащие нуклеотидные последовательности промоторов и прилегающие к промоторам регуляторные последовательности, с которыми связываются регуляторные белки. Кроме того, в состав экзонов входят участки на 3'-конце мРНК-транскрипта между терминатором и поли-А последовательностью.

РНК-транскрипт

Рис. 3.13. Схема образования зрелой мРНК из РНК-транскрипта

Экз. 1, 2, 3, 4, 5 – экзоны в составе РНК-транскрипта; Инт. 1, 2, 3, 4 – интроны в составе РНК-транскрипта; mРНК – матричная РНК (мРНК); поли-А – нуклеотидная последовательность на 3'-конце мРНК из повторяющихся остатков адениловой кислоты.

Интроны представляют собой участки мРНК-транскрипта, не кодирующие структуру белков, но они могут включать регуляторные последовательности, участвующие в регуляции транскрипции. Число интронов в составе эукариотических генов варьирует от одного до нескольких десятков, и их общая длина может во много раз превышать длину экзонов.

Каждый экзон в структуре гена кодирует определённый участок в белковой молекуле длиной 40–50 аминокислотных остатков, который представляет собой отдельный функциональный элемент третичной структуры полипептида (относительно автономный участок белковой молекулы). Из таких элементов в целом и состоит белковая молекула. Если в двух разных белках содержится одинаковая структура, то она кодируется одним и тем же экзоном. Путём повторения и перекомбинации экзонов обеспечивается генетический механизм построения пространственной структуры белков из небольших автономных единиц, представляющих собой отдельные самостоятельные элементы вторичной и третичной структуры составляющих белки полипептидов.

В ходе процессинга происходит удаление из структуры мРНК-тран-скрипта с помощью ферментов интронов, а экзоны соединяются в определённой последовательности, образуя функционально активную мРНК. Процесс соединения экзонов в функционально активную мРНК называют сплайсингом. Процессинг и сплайсинг мРНК представляют собой единый процесс образования зрелых мРНК, способных участвовать в синтезе белков. Активную роль в процессе сплайсинга выполняют специфические ядерные белки, а также малые ядерные РНК, синтез которых, как и мРНК, катализируют РНК-полимеразы II. Эти РНК содержат много остатков уридиловой кислоты и имеют длину от 90 до 140 нуклеотидных остатков.

Процессинг на 3'-конце мРНК-транскриптонов включает узнавание специфической эндонуклеазной терминаторной последовательности ААУААА, находящейся на расстоянии 11–30 нуклеотидных остатков от 3'-конца функционально активной мРНК, и отщепление от этого конца той части мРНК-транскрипта, которая не входит в состав зрелой мРНК. После этого к 3'-концу мРНК присоединяются остатки адениловой кислоты (до 100 таких остатков).

В бактериальных клетках большая часть мРНК, синтезируемой в ходе транскрипции, не подвергается процессингу. Однако синтез функционально активных молекул рРНК и тРНК включает посттранскрипционные изменения, т. е. транскрипты рРНК и тРНК бактерий проходят через механизм процессинга. Гены рРНК и тРНК бактерий образуют единый оперон, после транскрипции которого, синтезируется РНК-транскрипт, включающий полирибонуклеотидные последовательности 23S-РНК, 16S-РНК, 5S-РНК, тРНК и соединяющие их участки РНК, которые в ходе процессинга подвергаются расщеплению.

В клетках высших организмов 28S-, 18S- и 5S-рРНК синтезируются в виде одного высокомолекулярного транскрипта, из которого они выщепляются в ходе процессинга. Образуемые в ядрах клеток высших организмов предшественники тРНК содержат интрон, включающий последовательность из 14–16 нуклеотидных остатков, которые следуют через один нуклеотидный остаток за 3'-концом антикодона. Молекула предшественника расщепляется эндонуклеазой, а образующиеся полинуклеотидные фрагменты экзонов фосфорилируются и соединяются фосфодиэфирной связью под действием специфической лигазы. Выщепление из общего РНК-транскрипта биохимического предшественника тРНК, включающего около 100 нуклеотидных остатков, катализирует фермент РНКаза III. После осушествления процессинга и сплайсинга РНК-транскриптов образуются функционально активные молекулы рРНК, тРНК и мРНК, которые транспортируются из ядра в цитоплазму клетки и участвуют там в процессах синтеза белков.