30. Генетическая инженерия.

Плазмиды представляют собой молекулы ДНК, как и бактериальные хромосомы, имеют кольцевую структуру, но они значительно меньше хромосом. Плазмиды определяют такой признак бактериальных клеток, как устойчивость к лекарственным препаратам, например, антибиотикам. Чрезвычайно важной особенностью плазмид является их способность к переносу из одной клетки в другую.

Если в плазмиду ввести фрагмент ДНК, то он будит реплицироваться вместе с плазмидой. Благодаря этому можно размножать (клонировать) тот или иной интересующий человека ген.

Основу генетической инженерии составляет различные экспериментальные методы выделения нужного гена и объединения его с генетическими векторами. В качестве генетического вектора часто используется плазмидная ДНК. После этого полученные гибридные (рекомбинантные) молекулы ДНК вводят в бактериальные клетки. В репликации вектора происходит увеличение численности гибридных молекул ДНК в бактериальных клетках. Этот процесс называется клонирования рекомбинантных ДНК. Ход генноинженерных манипуляций можно разделить на четыре этапа: 1)выделение ДНК; 2)разделение ДНК на фрагменты; 3)соединение (рекомбинация) фрагментов ДНК, происходящих из разных организмов; 4)введение рекомбинантной ДНК в соответствующие клетки, где они подвергаются репликации и где происходит проявление действия нужного гена.

При использования фага в качестве вектора лимитирующим фактором является емкость белковой оболочки (капсида), поэтому при конструировании вектора обычно употребляют мутанты фага с делениями (делеция - это утрата части хромосомы) или фаги, у которых путем воздействия рестриктазы Eco RI были вызваны искусственные делеции.

Делеции увеличивают объем' свободного пространства капсида. благодаря чему в него можно поместить нужные для осуществления .трансформации гены. Этими генами могут быть не только выделенные из живых организмов, но и синтезированные химически. Доказано, что искусственные гены функционируют в клетке точно также, как и натуральные.

Введение рекомбинантной ДНК в систему, где она могла бы реплицироваться и нормально функционировать, т.е. управлять синтезом определенных белков, является заключительным этапом генноинженерных манипуляций. В качестве такой системы часто употребляется бактерии кишечной палочки как объект, наиболее изученный в генетическом плане. Бактерии, несущие нужный ген, отбираются затем с помощью того или иного приема. Нужный ген вводится, например, вместе с геном, определяющим устойчивость кишечной палочки к какому-нибудь антибиотику.

Методы генетической инженерии позволяют осуществлять целенаправленную эволюцию живых организмов, резко активизировать селекционный процесс. Вместо случайно возникших мутаций исследователи получили возможность конструирования мутантных форм по заранее составленному плану. Генетическая инженерия позволяет преодолевать барьеры несовместимости, нескрещиваемости, которые поставила природа на пути смешения видов.

31. Клеточная инженерия

В основе лежит метод соматической гибритизации, т е слияния двух не половых( Соматических) клеток.

Сущность метода выращивания изолированных тканей растений заключается в том, что выделенный кусочек ткани стерилизуется для уничтожения находящихся на поверхности микроорганизмов и переносится с соблюдением правил асептики на искусственную питательную среду, включающую в себя минеральные соли, органические вещества (сахара, аминокислоты), фитогормоны (ауксины, цитокинины).

Питательная среда может быть жидкой или твердой. Твердость питательной среды создается путем добавления в нее агар-агара, добываемого из некоторых водорослей.

Основными компонентами питательных сред, предназначенных для культивирования изолированных тканей, являются минеральные соли, содержащие азот, фосфор, калий, серу, магний, кальций, железо. При отсутствии в питательной среде любого из этих макроэлементов ткани плохо растут и даже отмирают.

Большое значение для культивируемых тканей имеют микроэлементы - цинк, бор, медь, марганец. Из углеводов лучшим источником углерода является сахароза. В качестве азотсодержащих органических веществ в большинстве случаев используются гидролизаты белков (казеина) и некоторые аминокислоты.

На такой питательной- среде изолированные дифференцированные клетки начинают делиться. В результате деления изолированных дифференцированных клеток на искусственной питательной среде образуется масса однородных недифференцированных клеток - каллюс. Кусочки каллюса можно переносить с одной питательной среды на другую. При этом клетки каллюса способны размножаться неопределенно долгое время.

При изменении условий культивирования в каллюсе могут возникать очаги дифференциации, превращающиеся затем в - зародышеобразные структуры, в которых можно различить зачаточную почечку и зачаточный корешок.

Процесс вторичной дифференцировки клеток можно разделить на две фазы. Первая фаза - это образование в массе однородных клеток каллюса очагов регенерационной меристомы и возникновение зародышеобразных структур. Во время второй фазы происходит рост зародышеобразных структур, для чего л нужно наличие в питательной среде, ауксинов. В зависимости от соотношения ауксинов и цитокининов происходит преимущественный рост тех ил%ных органов.

Наряду с культивированием тканей физиологи растений используют глубинное культивирование клеток растений - метод клеточных суспензий. Выращивание отдельной изолированной клетки включает в себя два этапа. Первый этап заключается в изолировании неповрежденной жизнеспособной клетки из ткани целого растения или из культивируемого каллюса. На втором этапе необходимо .создать условия для деления и роста изолированной клетки.

Освобожденные тем или иным путем клетки переносятся затем в жидкую питательную среду, которая при помощи соответствующих механизмов перемешивается и аэрируется. Здесь важно избавиться от крупных агрегатов.

Для этих целей в промышленном масштабе используются ферментеры, а в лабораторных (для проведения эксперимента ) - установки качалочного типа.