- •Российский университет дружбы народов
- •К практическим занятиям по биохимии
- •Авторский коллектив:
- •Предисловие как пользоваться этим учебным пособием?
- •Список сокращений и условных обозначений
- •Техника безопасности при работе в биохимической лаборатории
- •1. Общие требования безопасности
- •Классификация химических реактивов в биохимической лаборатории
- •2. Требования безопасности перед началом работ
- •3. Требования безопасности во время работы
- •4. Требование безопасности в аварийных ситуациях
- •5.Требование безопасности по окончании работы
- •Раздел 1: Аминокислоты и простые белки Введение
- •1.1 Проверка знаний по органической химии
- •1.2. Цветные реакции на белки и аминокислоты. Реакции осаждения и денатурации белков а. Цветные реакции на белки и аминокислоты
- •Б. Реакции осаждения и денатурации белков
- •1.3. Количественное определение белка биуретовым методом. Построение калибровочных кривых
- •1 .4. Диализ белков. Бумажная хроматография аминокислот
- •А. Диализ
- •1.5. Коллоквиум I по теме «Аминокислоты и простые белки»
- •Раздел 2: Сложные белки, нуклеиновые кислоты и ферменты Введение
- •2.1 Действие амилазы на крахмал. Влияние температуры на активность амилазы а. Действие амилазы на крахмал
- •Б. Изучение влияния температуры на скорость ферментативной реакции
- •2.2. Количественное определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови с п-нитрофенилфосфатом
- •2.3. Коллоквиум II по теме: «Сложные белки, нуклеиновые кислоты и ферменты» Вопросы, для самостоятельной подготовки
- •Варианты письменной части коллоквиума
- •Варианты заданий на компьютерном тестировании
- •Правильные ответы
- •Раздел 3: Витамины, липиды, гормоны Введение
- •3.1. Количественное определение витаминов с и р.
- •3.3. Влияние гормонов на содержание глюкозы в крови
- •3.4. Коллоквиум III по теме «Витамины, липиды, гормоны»
- •Раздел 4: Метаболизм. Биоэнергетика клеток. Химия и обмен углеводов Введение
- •4.1. Специфичность действия ферментов распада углеводов: амилазы и сахаразы
- •4.2. Количественное определение глюкозы. Построение «сахарных кривых»
- •4.3. Определение активности сукцинатдегидрогеназы в мышцах. Количественное определение пирувата в моче
- •4.4 Коллоквиум IV по теме: «Метаболизм. Биоэнергетика клеток. Химия и обмен углеводов»
- •Правильные ответы
- •Раздел 5: Обмен липидов и его регуляция Введение
- •5.1. Кинетика действия липазы.
- •5.2. Количественное определение фосфатидилхолинов (лецитинов) по фосфору
- •I. Приготовление рабочего раствора сыворотки.
- •II. Определение концентрации фосфатидолхолинов по содержанию фосфора.
- •5.3. Количественное определение холестерина в сыворотке крови
- •5.4. Количественное определение малонового диальдегида
- •5.5. Коллоквиум по теме «Обмен липидов»
- •Раздел 6: Переваривание белков и обмен аминокислот
- •6.1. Количественный анализ желудочного сока. Определение свободной, связанной, общей соляной кислоты и общей кислотности желудочного сока.
- •6.2. Количественное определение аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в сыворотке крови
- •6.3. Доказательство проявления активности аланин-аминотрансферазы (АлАт) методом бумажной хроматографии
- •6.4. Экспресс-метод определения повышенного содержания фенилаланина в плазме крови
- •6.5. Количественное определение мочевины в моче ферментативным уреазным/фенол-гипохлоритным методом
- •6.6. Количественное определение креатинина в моче
- •6.7. Коллоквиум по теме: «Обмен простых белков» Вопросы, для самостоятельной подготовки
- •Варианты письменной части коллоквиума
- •Правильные ответы
- •Раздел 7: Обмен хромопротеинов и нуклеопротеинов. Биохимия крови и мочи. Биосинтез нуклеиновых кислот и белков. Введение
- •7.1. Определение общего билирубина в сыворотке крови
- •7.2. Количественное определение мочевой кислоты в моче
- •7.3. А. Определение активности -амилазы в моче
- •7.3. Б. Составные части мочи в норме и при патологии
- •7.4. Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови
- •7.5. Определение активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови
- •7.6. Коллоквиум по теме: «Обмен хромопротеинов и нуклеопротеинов. Биохимия крови и мочи. Биосинтез нуклеиновых кислот и белка». Вопросы, для самостоятельной подготовки
- •Варианты письменной части коллоквиума
- •Правильные ответы
- •Раздел 8: Подготовка к экзамену
- •8.1. Основные вопросы, выносимые на обсуждение
- •8.2. Пример экзаменационного тестового задания по курсу биохимии
- •59. Найти соответствие между процессом и его графическим изображением
- •60. Цикл мочевинообразования установил
- •Ответы к экзаменационному тесту
- •Раздел 9: Приложения
- •9.1. Термины, различающиеся по смыслу, но сходные по написанию и звучанию
- •9.2. Стандартные биохимические наборы и реактивы, используемые в практикуме
- •9.3. Рекомендуемая литература
- •Содержание
- •Раздел 7: Обмен хромопротеинов и нуклеопротеинов. Биохимия крови и мочи. Биосинтез нуклеиновых кислот и белков. 126
- •Раздел 8: Подготовка к экзамену 148
- •Раздел 9: Приложения 161
7.4. Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови
Холинэстераза – это фермент, который катализирует гидролиз эфиров холина:
(СН3)3-N+-СН2-СН2-О-С(О)-СН3 (СН3)3-N+-СН2-СН2-ОН + СН3СООН
Различают два типа холинэстераз, которые обозначают как истинную холинэстеразу (ацетилхолинэстераза) и псевдохолинэстераза (холинэстераза – ХЭ). Истинная холинэстераза (ацетилхолингидролаза, КФ 3.1.1.7.) отличается узкой субстратной специфичностью, гидролизует преимущественно ацетилхолин. Псевдохолинэстераза (ацетилхолин-ацилгидролаза, КФ 3.1.1.8.) обладает более широкой субстратной специфичностью и гидролизует другие эфиры холина.
Истинная холинэстераза локализована в эритроцитах, мышечной и нервной тканях, играет важную роль в передаче нервного импульса путем разрушения ацетилхолина в нервных синапсах и в нервно-мышечном сопряжении.
Псевдохолинэстераза присутствует в сыворотке крови, печени, поджелудочной железе и других внутренних органах.
При заболеваниях и поражениях печени активность холинэстеразы в сыворотке крови снижается, т.к. нарушается синтез фермента гепатоцитами. Низкий уровень ХЭ может наблюдаться при раковых заболеваниях, острых инфекциях, инфаркте миокарда, беременности, а также у курильщиков.
Активность ХЭ сыворотки крови снижается при отравлениях фосфорорганическими соединениями, инсектицидами, нервно-паралитическими газами или другими сходными по химическому строению веществами, которые являются сильными ингибиторами ХЭ.
Повышенный уровень ХЭ может наблюдаться при интенсивных физических тренировках, а также при приеме ряда терапевтических препаратов.
Цель работы
Определить активность фермента холинэстеразы в сыворотке крови и сравнить с нормой.
Принцип метода
В ходе реакции, катализируемой холинэстеразой, образуется уксусная кислота, что приводит к снижению рН реакционной среды. Если проводить реакцию в присутствии индикатора (м-нитрофенола), то при понижении рН наблюдается обесцвечивание раствора, пропорциональное ферментативной активности ХЭ. Для определения фонового оптического поглощения готовят контрольный раствор, в котором холинэстеразную активность сыворотки ингибируют прозерином. При 400 нм измеряют оптическую плотность в контрольной и опытной пробах, и их разность используют для вычисления активности ХЭ по калибровочному графику зависимости Dк–Dоп от активности ХЭ. За единицу активности холинэстеразы (ед.) принимают такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоль уксусной кислоты из ацетилхолина за 10 мин при 25оС.
Прозерин
Выполнение работы (см. приложение )
Маркируют две пробирки и вносят в них последовательно (перемешивая содержимое пробирок после добавления каждого реагента):
|
Этапы и реактивы |
Опыт |
Контроль |
1. |
Физиологический раствор, мл |
0,2 |
0,2 |
2. |
Сыворотка крови, мл |
0,2 |
0,2 |
3. |
Прозерин, мл |
- |
0,2 |
4. |
Ацетилхолин, мл |
0,2 |
0,2 |
5. |
Н2О, мл |
3,0 |
2,8 |
6. |
Инкубируют 10 минут при температуре 25С |
|
|
7. |
Раствор м-нитрофенола, мл |
2,0 |
2,0 |
8. |
Фотометрируют против Н2О ( = 400 нм, толщина кюветы 1 см) D400 |
Do |
Dк |
9. |
Dк–Dоп |
|
|
Определяют активность холинэстеразы по калибровочному графику зависимости Dк–Dоп от активности ХЭ.
Калибровочный график
Активность холинэстеразы, ед. |
Dк – Doп |
20 40 60 80 100 120 |
0,08 0,12 0,20 0,25 0,30 0,35 |
Норма: 40-120 единиц.
Выводы
Тестовые задания по теме: «Нормальные и патологические составные части крови и мочи»
1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»
Креатин в норме определяется в сыворотке крови и моче.
Содержание холестерина и мочевины в крови (ммоль/л) сопоставимо с содержанием глюкозы.
В сыворотке крови в норме больше пировиноградной кислоты, чем молочной.
Содержание глутамина в сыворотке крови (мкмоль/л) сопоставимо с концентрацией аланина.
Общий билирубин определяется как в сыворотке крови, так и в моче.
Протеинурия может выражаться в появлении в моче альбуминов.
Возможно ли выведение ацетоновых тел с мочой более 100 г/сутки при сахарном диабете?
Является ли фосфатидилхолин нормальным компонентом сыворотки крови?
Атерогенны ли ЛПВП?
Нормально ли выведение 10 г/сутки хлористого натрия с мочой?
Сопоставимо ли суточное выведение мочевины, креатинина и мочевой кислоты с мочой?
Присутствует ли стеркобилин в моче?
2) Выбрать один правильный ответ
Азот пиримидиновых оснований выводится из организма в основном в виде:
|
Патологическими компонентами мочи не являются:
|
3) Установить соответствие между поражённым органом и повышением активности фермента в сыворотке крови
1. инфаркт миокарда 2. поражение клеток печени 3. воспаление поджелудочной железы 4. карцинома предстательной железы |
А. орнитинкарбамоилтрансфераза Б. амилаза В. кислая фосфатаза Г. креатинкиназа |