- •Российский университет дружбы народов
- •К практическим занятиям по биохимии
- •Авторский коллектив:
- •Предисловие как пользоваться этим учебным пособием?
- •Список сокращений и условных обозначений
- •Техника безопасности при работе в биохимической лаборатории
- •1. Общие требования безопасности
- •Классификация химических реактивов в биохимической лаборатории
- •2. Требования безопасности перед началом работ
- •3. Требования безопасности во время работы
- •4. Требование безопасности в аварийных ситуациях
- •5.Требование безопасности по окончании работы
- •Раздел 1: Аминокислоты и простые белки Введение
- •1.1 Проверка знаний по органической химии
- •1.2. Цветные реакции на белки и аминокислоты. Реакции осаждения и денатурации белков а. Цветные реакции на белки и аминокислоты
- •Б. Реакции осаждения и денатурации белков
- •1.3. Количественное определение белка биуретовым методом. Построение калибровочных кривых
- •1 .4. Диализ белков. Бумажная хроматография аминокислот
- •А. Диализ
- •1.5. Коллоквиум I по теме «Аминокислоты и простые белки»
- •Раздел 2: Сложные белки, нуклеиновые кислоты и ферменты Введение
- •2.1 Действие амилазы на крахмал. Влияние температуры на активность амилазы а. Действие амилазы на крахмал
- •Б. Изучение влияния температуры на скорость ферментативной реакции
- •2.2. Количественное определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови с п-нитрофенилфосфатом
- •2.3. Коллоквиум II по теме: «Сложные белки, нуклеиновые кислоты и ферменты» Вопросы, для самостоятельной подготовки
- •Варианты письменной части коллоквиума
- •Варианты заданий на компьютерном тестировании
- •Правильные ответы
- •Раздел 3: Витамины, липиды, гормоны Введение
- •3.1. Количественное определение витаминов с и р.
- •3.3. Влияние гормонов на содержание глюкозы в крови
- •3.4. Коллоквиум III по теме «Витамины, липиды, гормоны»
- •Раздел 4: Метаболизм. Биоэнергетика клеток. Химия и обмен углеводов Введение
- •4.1. Специфичность действия ферментов распада углеводов: амилазы и сахаразы
- •4.2. Количественное определение глюкозы. Построение «сахарных кривых»
- •4.3. Определение активности сукцинатдегидрогеназы в мышцах. Количественное определение пирувата в моче
- •4.4 Коллоквиум IV по теме: «Метаболизм. Биоэнергетика клеток. Химия и обмен углеводов»
- •Правильные ответы
- •Раздел 5: Обмен липидов и его регуляция Введение
- •5.1. Кинетика действия липазы.
- •5.2. Количественное определение фосфатидилхолинов (лецитинов) по фосфору
- •I. Приготовление рабочего раствора сыворотки.
- •II. Определение концентрации фосфатидолхолинов по содержанию фосфора.
- •5.3. Количественное определение холестерина в сыворотке крови
- •5.4. Количественное определение малонового диальдегида
- •5.5. Коллоквиум по теме «Обмен липидов»
- •Раздел 6: Переваривание белков и обмен аминокислот
- •6.1. Количественный анализ желудочного сока. Определение свободной, связанной, общей соляной кислоты и общей кислотности желудочного сока.
- •6.2. Количественное определение аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в сыворотке крови
- •6.3. Доказательство проявления активности аланин-аминотрансферазы (АлАт) методом бумажной хроматографии
- •6.4. Экспресс-метод определения повышенного содержания фенилаланина в плазме крови
- •6.5. Количественное определение мочевины в моче ферментативным уреазным/фенол-гипохлоритным методом
- •6.6. Количественное определение креатинина в моче
- •6.7. Коллоквиум по теме: «Обмен простых белков» Вопросы, для самостоятельной подготовки
- •Варианты письменной части коллоквиума
- •Правильные ответы
- •Раздел 7: Обмен хромопротеинов и нуклеопротеинов. Биохимия крови и мочи. Биосинтез нуклеиновых кислот и белков. Введение
- •7.1. Определение общего билирубина в сыворотке крови
- •7.2. Количественное определение мочевой кислоты в моче
- •7.3. А. Определение активности -амилазы в моче
- •7.3. Б. Составные части мочи в норме и при патологии
- •7.4. Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови
- •7.5. Определение активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови
- •7.6. Коллоквиум по теме: «Обмен хромопротеинов и нуклеопротеинов. Биохимия крови и мочи. Биосинтез нуклеиновых кислот и белка». Вопросы, для самостоятельной подготовки
- •Варианты письменной части коллоквиума
- •Правильные ответы
- •Раздел 8: Подготовка к экзамену
- •8.1. Основные вопросы, выносимые на обсуждение
- •8.2. Пример экзаменационного тестового задания по курсу биохимии
- •59. Найти соответствие между процессом и его графическим изображением
- •60. Цикл мочевинообразования установил
- •Ответы к экзаменационному тесту
- •Раздел 9: Приложения
- •9.1. Термины, различающиеся по смыслу, но сходные по написанию и звучанию
- •9.2. Стандартные биохимические наборы и реактивы, используемые в практикуме
- •9.3. Рекомендуемая литература
- •Содержание
- •Раздел 7: Обмен хромопротеинов и нуклеопротеинов. Биохимия крови и мочи. Биосинтез нуклеиновых кислот и белков. 126
- •Раздел 8: Подготовка к экзамену 148
- •Раздел 9: Приложения 161
5.3. Количественное определение холестерина в сыворотке крови
Холестерин (холестерол) – высший, полициклический, ненасыщенный одноатомный, вторичный спирт.
Большая часть холестерина в крови находится в виде холестеридов – сложных эфиров с высшими жирными кислотами: пальмитиновой, стеариновой или олеиновой. Холестерин и его эфиры нерастворимы в воде и образуют комплексные соединения со специфическими белками, которые являются обязательными компонентами ЛП сыворотки крови и клеточных мембран, влияют на физико-химические свойства плазматической мембраны, регулируют ее проницаемость и влияют на активность интегрированных в нее ферментов. Из холестерина образуются физиологически активные вещества: желчные кислоты, стероидные гормоны и провитамины группы D. Холестерин поступает в организм с пищей, но в основном синтезируется из ацетил-КоА в печени и, частично, в кишечнике. Из печени в ткани он попадает в составе ЛПНП. Избыток холестерина из тканей удаляется ЛПВП в печень. Холестерин – это основной компонент ЛПНП и минорный ЛПОНП и ЛПВП.
На содержание холестерина в сыворотке крови влияют различные факторы: наследственность, питание, состояние эндокринных желез и внутренних органов (печень, почки). Так например, повышение уровня холестерина в сыворотке крови наблюдается при атеросклерозе, семейной гиперхолестеринемии, декомпенсированном сахарном диабете, нефротическом синдроме, хроническом гепатите, гипопротеинемии. Понижение концентрации холестерина происходит при остром гепатите, болезни Гоше, острых инфекциях, кахексии, анемии, остром панкреатите. Исследуется роль холестерина в процессах нейродегенерации и развитии болезни Альцгеймера.
Цель работы
Определить содержание холестерина в сыворотке крови. Сравнить полученное значение с нормой.
Принцип метода
Холестеринэстераза гидролитическим путем расщепляет сложноэфирную связь в эфирах холестерина (холестеридах). Образовавшийся свободный холестерин как спирт окисляется холестериноксидазой до кето-формы холестерина (холестенона) и пероксида водорода. Последний под действием пероксидазы способен окислять фенол при участии 4-аминоантипирина до окрашенного соединения - хинонимина. Оптическую плотность окрашенного раствора хинонимина определяют фотометрически. Расчёт концентрации холестерина проводят по сравнению со стандартным раствором.
Выполнение работы (см. приложение)
Реактивы и этапы |
Пробы |
|||||
Опыт |
Контроль |
Стандарт |
||||
1. Реагент, мл (хромогенная смесь*) |
2 |
2 |
2 |
|||
2. Сыворотка крови, мл ** |
0,05 |
— |
— |
|||
3. Н2О, мл |
— |
0,05 |
— |
|||
4. Стандартный раствор холестерина (4,65 ммоль/л), мл |
— |
— |
0,05 |
|||
Инкубируют 10 мин при 25С |
||||||
Фотометрируют против Н2О ( = 500 нм, толщина кюветы 3 мм) D500 |
|
|
|
|||
Dоп - Dк |
|
|
|
|||
Dст - Dк |
|
|
|
*в состав реагента входят: холестеринэстераза, холестериноксидаза, пероксидаза, 4-аминоантипирин, фенол, фосфатный буфер – рН 6.5.
** При проведении анализа лошадиной сыворотки следует помнить, что содержание холестерина в ней значительно ниже, чем в сыворотке крови человека.
Расчет результатов
С = • 4,65 ммоль/л
где 4,65 ммоль/л – концентрация холестерина в стандартном растворе.
Норма: 4,4 – 5,5 ммоль/л.
Выводы
Тестовые задания по теме: «β-Окисление высших жирных кислот и их биосинтез»
1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»
В β-окислении жирных кислот участвуют ФАД- и НАД-зависимые дегидрогеназы.
Полное окисление одной молекулы пальмитиновой кислоты до СО2 и Н2О сопровождается образованием 130 молекул АТФ.
Линоленовая кислота является незаменимой для человека.
Для образования мевалоновой кислоты необходим НАДФН (Н+).
Простагландины образуются из полиненасыщенных жирных кислот.
Холестерин в сыворотке крови находится только в свободном состоянии.
Можно ли заменить НАДФН (Н+) на НАДН(Н+).в биосинтезе высших жирных кислот?
Участвует ли биотин в биосинтезе жирных кислот?
Возможно ли полное превращение нейтральных жиров в углеводы в животном организме?
Обратимы ли все стадии β-окисления жирных кислот в митохондриях?
Нужны ли витамины В2 и РР для нормального протекания -окисления жирных кислот?
Повышается ли с возрастом концентрация холестерина в сыворотке крови человека?
2) Выбрать один правильный ответ
Кофермент, участвующий в биосинтезе жирных кислот, но неучаствующий в их окислении: ФАД НАД НАДФН (Н+) КоА ТПФ |
НАДФН (Н+) для биосинтеза жирных кислот и холестерина поставляется за счет: гликолиза ЦТК β-окисления жирных кислот биологического окисления пентозофосфатного пути |
3) Установить последовательность образования метаболитов β-окисления жирных кислот
1 2 3 4 5 |
А. Еноил-КоА Б. Кетоацил-КоА В. Оксиацил-КоА Г. Ацил-КоА Д. Ацетил-КоА |