2.5. Особенности спектрофотометрии биологических объектов

Выше уже указывалось, что биологические объекты характеризуются особенностями, которые часто сильно затрудняют применение спектрофотометрического анализа. Наибольшее влияние на его результаты оказывают такие свойства биологических объектов, как склонность к светорассеиванию и неоднородное распределение хромофоров по освещенной площади образца.

2.5.1. Светорассеивание и его влияние на результаты спектрофотометрического анализа.

Определение 15:

Светорассеиванием называется любое отклонение квантов излучения в веществе объекта от первоначального направления распространения, если переизлучение фотонов молекулами осуществляется быстрее, чем за 10^-12 секунды.

Если взаимодействие кванта излучения с молекулой-хромофором при поглощении можно рассматривать как неупругое столкновение, приводящее к исчезновению кванта, то при светорассеивании столкновение молекулы и кванта – почти упругое, т.е. фотон молекулой не поглощается. Все взаимодействие электронов и кванта при этом затрагивает только колебательные и вращательные энергетические подуровни, а межорбитальные электронные переходы не наблюдаются. Поскольку при таком характере взаимодействия размениваемые порции энергии очень невелики, сам процесс переизлучения очень короток.

На макроуровне причиной светорассеивания является присутствие в образце так называемых оптических неоднородностей, областей, в которых коэффициент преломления отличается от среднего по объекту. Преломление света на таких неоднородностях и его отражение от их границ – основные причины светорассеивания (рис. 9).

В биологических исследованиях наиболее часто встречающимся объектом, обладающим выраженным светорассеиванием, являются суспензии клеток в водных средах инкубации. Роль оптических неоднородностей здесь выполняют сами клетки – коэффициент преломления у клеточной цитоплазмы значительно выше, чем у окружающей клетки водной среды.

При определении оптической плотности светорассеивающего образца часть

Рассеянное излучение

2

1

Рассеянное излучение

n_ч>n

Оптические неоднородности

Рисунок 9. Схема, поясняющая причины рассеивания света в присутствии оптических неоднородностей в образце. При коэффициенте преломления внутри неоднородностей n_ч, большем, чем средний коэффициент преломления по образцу n, оптическое излучение, попавшее на эти неоднородности, будет либо преломляться (1), либо отражаться (2). В любом случае направление распространения квантов измениться – произойдет светорассеивание. То же самое будет наблюдаться и если n_ч будет меньше n.

рассеянных квантов излучения, если не предпринять специальных мер, не попадёт на фотодетектор спектрофотометра и не будет регистрироваться. В результате измеренная величина  окажется заниженной, а измеренная величина оптической плотности (D_изм) – завышенной (рис. 10).

А.

J

J₀

ФД

Б.

J₀

ФД

J

Рисунок 9. Схема, поясняющая причины увеличения измеряемой оптической плотности при наличии светорассеивания в образце. Если светорассеивание в образце отсутствует (А), выходящий из него световой пучок J остаётся таким же параллельным, как и падающий на образец тестирующий пучок J₀. Если в образце имеется светорассеивание (Б), выходящий пучок J становится расходящимся, и составляющие его кванты находятся в пределах некоторого телесного угла (на рисунке обозначен овалом). Часть квантов пучка J при этом отклоняется настолько сильно, что не попадает на фотодетектор спектрофотометра (ФД). Эти кванты не регистрируются и воспринимаются прибором, как поглощенные. Измеряемая оптическая плотность существенно завышается по сравнению с истинной.

Помимо указанного увеличения D_изм, светорассеивание может повлиять и на истинное значение оптической плотности объекта. Дело в том, что при большом количестве оптических неоднородностей в образце кванты, проходя через него, могут изменить направление своего распространения несколько раз. Такая ситуация называется многократным светорассеиванием. В результате многократного светорассеивания фотоны двигаются в веществе образца по сложной ломаной траектории, проходя при этом расстояние, значительно превышающее толщину кюветы. Вместе с тем, напомним, что величина l в законе Бугера-Ламберта-Бера – это оптический путь, т.е. расстояние, проходимое светом в веществе образца. Увеличение l из-за многократного светорассеивания неизбежно приводит к росту оптической плотности объекта. В результате расчет концентрации хромофоров по закону Бугера-Ламберта-Бера дает завышенный результат.

Многократное светорассеивание – наиболее «неприятный» из оптических феноменов, мешающих проведению спектрофотометрических измерений. Дело в том, что устранить увеличение оптического пути с помощью приборных приставок или теоретических поправок невозможно, поскольку количество актов рассеивания квантов в объекте, как правило, неизвестно. Более того, чаще всего это количество индивидуально для каждого из проходящих через такой объект фотонов. Поэтому единственным способом ухода от искажений в величине D_изм из-за многократного светорассеивания и увеличения оптического пути является модификация образца, направленная на сведение многократного светорассеивания к однократному. Этого можно достичь, либо снизив концентрацию оптических неоднородностей (например, клеток) в объекте, либо, если это нежелательно, проводя измерения в очень тонкой кювете.

Но и однократное светорассеивание существенно искажает результаты как количественного, так и качественного спектрофотометрического анализа. Качественный анализ оказывается осложнен из-за того, что степень отклонения квантов от исходного направления распространения в образце вследствие рассеивания зависит от длины волны тестирующего излучения. В первом приближении (см. ниже) можно считать, что величина светорассеивания обратно пропорциональна этому показателю. Поскольку при регистрации спектра поглощения рассеивающего свет объекта на каждой длине волны тестирующего излучения измеряется сумма ослаблений света в объекте из-за истинного поглощения и светорассеивания, полученный спектр также будет суммой спектров истинного поглощения и светорассеивания. Естественно, вид его будет сильно искажён, и решение качественной задачи станет невозможным.

Сильные искажения, вносимые в результаты спектрофотометрического анализа светорассеиванием, привели к разработке ряда приемов, позволяющих правильно измерять величину истинного поглощения в мутных (т.е. рассеивающих свет) объектах. Условно эти приемы можно разделить на 3 группы:

1. воздействия на изучаемый объект, направленные на снижение светорассеивания в нём;

2. применение специальных приборных приставок (приспособлений), позволяющих правильно измерить истинную величину оптической плотности мутного объекта;

3. коррекция уже измеренных искаженных светорассеиванием спектров поглощения с помощью специальных методов обсчета.

Рассмотрим эти приемы подробнее.

Воздействия на объект, снижающие величину светорассеивания в нём

Поскольку основной причиной возникновения светорассеивания является оптическая неоднородность объекта, ослабить рассеивание света в нем возможно путем её устранения. Достичь этого можно либо изменив коэффициент преломления света в оптических неоднородностях (n_ч), добиваясь того, чтобы он стал равен среднему по образцу, либо изменив средний коэффициент преломления образца (n), с тем, чтобы он стал равен n_ч.

Рассмотрим, как это достигается, на примере клеточной суспензии, наиболее распространенного светорассеивающего биологического объекта.

Как уже указывалось, оптическими неоднородностями в суспензии клеток в водной среде оказываются сами клетки. Для того, чтобы сделать такую суспензию немутной (т.е. ослабить или устранить светорассеивание в ней) необходимо либо (1) сделать коэффициент преломления клеточной цитоплазмы равным коэффициенту преломления водной среды инкубации, либо (2) подобрать такую среду инкубации, у которой коэффициент преломления был бы близок к величине этого показателя у цитоплазмы исследуемых клеток.

Технически гораздо проще реализовать первый из упомянутых методов. Для этого достаточно тем или иным способом лизировать находящиеся в образце клетки. Оптические неоднородности при этом исчезают, и объект перестает рассеивать свет. Например, при гемолизе (выходе гемоглобина из эритроцитов в среду инкубации) ранее мутная эритроцитарная суспензия становиться прозрачной, т.е. перестает рассеивать свет. К несчастью, лизис клеток обычно сильно влияет на состояние их компонентов, многие из которых теряют свою нативность. Естественно, лизированные клетки функционально неактивны. Поэтому данный метод устранения светорассеивания в клеточных суспензиях применяется достаточно редко.

Второй метод ослабления светорассеивания в клеточных суспензиях более трудоёмок. Для того, чтобы его реализовать, клетки помещаются в специальные среды с коэффициентом преломления, близким к таковому у их цитоплазмы. Для большинства клеток такими средами являются насыщенные растворы белка (например, сывороточного альбумина) и водно-глицериновые смеси. Концентрация белка в белковой среде или концентрация глицерина в водно-глицериновой смеси подбираются индивидуально, в зависимости от типа исследуемых клеток. К сожалению, оба типа сред инкубации, в которых клетки рассеивают свет слабо, не лишены недостатков. Для белковых сред чаще всего применяются сывороточные альбумины. Но эти белки содержат в своей полипептидной цепи ароматические аминокислотные остатки (в сывороточном альбумине человека имеется 2 триптофановых остатка и 18 – тирозиновых), из-за чего их растворы обладают сильным собственным поглощением в ультрафиолетовой части спектра. Естественно, это делает невозможным применение сред на основе сывороточных альбуминов для спектрофотометрии в этом спектральном диапазоне. С другой стороны, инкубация клеток в средах на основе водно-глицериновых смесей не всегда благоприятно сказываются на их выживаемости и функциональной активности.

В любом случае, путем простой замены среды инкубации полностью устранить светорассеивание в клеточной суспензии обычно не удается. Связано это с тем, что, во-первых, в большинстве клеток, помимо цитоплазмы, имеются многочисленные органеллы, коэффициент преломления света в которых может сильно отличаться цитоплазматического, а, во-вторых, даже коэффициент преломления цитоплазмы у отдельных индивидуальных клеток в образце неодинаков.

Поэтому, даже после исключения многократного светорассеивания и ослабления светорассеивания однократного, лучше всего исследовать спектры поглощения клеточных суспензий на спектрофотометрах, снабженных специальными устройствами, позволяющими правильно определять величину истинной оптической плотности мутных объектов.

Приборные устройства, позволяющие исключить влияние светорассеивания в объекте на величину измеряемой оптической плотности

Существует 3 варианта устройств, которые позволяют исключить влияние светорассеивания в образце на величину D_изм.

Самый простой – специальное кюветное отделение для мутных образцов, при установке в которое объект оказывается максимально приближен к фотодетектору. Диаметр выходной апертуры этого кюветного отделения (отверстия, через которое свет выходит из кюветного отделения и попадает на фотодетектор) и площадь фотокатода (собственно регистрирующей свет части) применяемого фотодетектора максимально увеличиваются (рис. 10). В результате большая часть рассеянных квантов попадает на фотодетектор и регистрируется. Не регистрируются лишь те фотоны, которые были рассеяны вбок или назад (в сторону источника света), но их количество обычно невелико. Величина D_изм оказывается приближенной к истинному значению D данного объекта.

ГА

J

J₀

ФД

Кювета

ГА

Рисунок 10. Схема расположения кюветы с образцом в специальном кюветном отделении для мутных объектов. В этом кюветном отделении кювета с образцом максимально приближена к фотодетектору (ФД), который снабжен фотокатодом большой площади. ГА – границы выходной апертуры кюветного отделения. Основная часть рассеянного в образце света попадает на фотодетектор и регистрируется, вследствие чего, несмотря на наличие светорассеивания в образце, D_изм D. Остальные обозначения те же, что и на рис. 9.

Следующее приборное устройство, позволяющее правильно измерить величину оптической плотности мутных объектов – так называемая светорассеивающая пластинка. Она представляет собой тонкую сильно рассеивающую свет пластинку с собственной мутностью, много большей, чем допустимая мутность (т.е. величина светорассеивания) в образце. Хромофоров светорассеивающая пластинка содержать не должна. Располагается это устройство вплотную за объектом. Лучше всего, если размер пластинки несколько больше размеров кюветы с образцом (рис. 11).

J

СРП

ГА

J₀

ФД

ГА

Кювета

Рисунок 11. Схема расположения кюветы с образцом и светорассеивающей пластины (СРП) в кюветном отделении спектрофотометра. Светорассеивающая пластина представляет из себя тонкую пластинку с высокой мутностью (сильным собственным светорассеиванием), устанавливаемую в тестирующем пучке излучения вплотную за кюветой с объектом. Материал пластины не должен содержать хромофоров с поглощением в области регистрации спектров. Размеры пластины должны быть несколько больше размеров кюветы с образцом. Другие обозначения те же, что и на рис. 10. Механизм устранения влияния светорассеивания на величину D_изм при установке светорассеивающей пластины см. в тексте.

При установке светорассеивающей пластинки весь свет, выходящий из кюветы с образцом, за исключением квантов, рассеянных назад и вбок, вне зависимости от того, под каким углом к направлению освещения он выходит, попадает в эту пластинку. За счет многократного перерассеивания в материале пластинки попавшие в нее кванты примерно равномерно распределяются по ее поверхности, поэтому поток излучения с единицы площади обратной по отношению к объекту стороны пластинки оказывается одинаковым во всех ее частях. С части площади обратной стороны светорассеивающей пластинки кванты попадают на фотодетектор и регистрируются. Введем следующие обозначения:

• S_пл – общая площадь светорассеивающей пластинки;

• S_изм – часть общей площади пластинки, с которой кванты излучения попадают на фотодетектор и регистрируются;

• J₀ – поток падающего на образец тестирующего излучения;

• J – суммарный поток выходящего из образца излучения.

Регистрируемый в присутствии светорассеивающей пластинки световой сигнал (J’), выходящий из образца, будет составлять:

В тех же условиях измерим световой поток через образец сравнения. Его величина (J₀’) будет составлять:

Измеряемая величина оптической плотности объекта в этом случае будет равна:

(29)

Поскольку используемая светорассеивающая пластинка только одна, отношение S_изм/S_пл будет одинаково и при измерении светового потока через объект, и при измерении светового потока через образец сравнения. Поэтому эти величины в выражении (29) можно сократить. В результате останется только искомая величина оптической плотности:

(30)

Нужно заметить, что, поскольку S_изм/S_пл всегда меньше единицы, установка светорассеивающей пластины несколько снижает чувствительность спектрофотометра. Однако это в полной мере компенсируется появлением возможности правильно измерять величину оптической плотности светорассеивающих образцов.

Выше уже указывалось, что светорассеивающая пластина не позволяет учитывать при определении оптической плотности светорассеивающего образца кванты излучения, рассеянные назад (по направлению к источнику света) и вбок (под углом 90⁰ к направлению освещения). Хотя таких квантов немного, некоторая ошибка при регистрации оптической плотности образца все-таки возникает. Этого недостатка в значительной мере лишена самая эффективная в плане устранения влияния рассеивания света в объекте на измеряемую оптическую плотность приборная приставка– интегрирующая сфера (ранее это устройство обозначалось также как интегрирующая сфера Ульбрихта). Интегрирующая сфера (ИС) представляет собой полую светонепроницаемую сферу, внутренняя поверхность которой покрыта диффузно отражающим свет материалом. Обычно для покрытия внутренней поверхности ИС применяются гидроокиси магния или цинка. Напомним, что диффузным отражением называется такое отражение излучения, при котором невозможно строго определить направление отражённого пучка света. Схема установки ИС в оптической схеме спектрофотометра приведена на рис. 12.

J₀

Образец

ФД

J

ИС

Рисунок 12. Схема расположения кюветы с образцом в интегрирующей сфере (ИС), дополняющей кюветное отделение спектрофотометра. ИС представляет из себя полую сферу, внутренняя поверхность которой покрыта диффузно отражающим свет материалом. Кювета с образцом устанавливается непосредственно внутрь сферы. Прямо проходящий через объект (нерассеянный) свет не должен при этом попадать на фотодетектор (ФД) без вторичного переизлучения стенками ИС.

Другие обозначения те же, что и на рис. 11. Механизм устранения влияния светорассеивания на величину D_изм при установке ИС описан в тексте.

При наличии ИС кювета с исследуемым образцом устанавливается внутрь сферы таким образом, чтобы прошедший через нее без рассеивания свет прямо на фотодетектор (ФД) не попадал. Все вышедшие из образца кванты излучения, включая значительную часть тех, которые были рассеяны вбок и назад, будут многократно переизлучены стенками ИС и равномерно распределены по её внутренней поверхности. Часть из них через выходное отверстие (выходную апертуру) ИС попадают на ФД прибора и регистрируются. Как и в случае светорассеивающей пластинки можно ввести следующие обозначения:

• S_сф – общая площадь внутренней поверхности ИС;

• S_изм – площадь выходной апертуры ИС, через которую кванты излучения попадают на фотодетектор и регистрируются;

• J₀ – поток падающего на образец тестирующего излучения;

• J – суммарный поток выходящего из образца излучения.

Регистрируемый в присутствии ИС световой сигнал (J’) от образца, будет составлять:

В тех же условиях измерим световой сигнал от образца сравнения. Его величина (J₀’) будет составлять:

Измеряемая величина оптической плотности объекта в этом случае будет равна:

(31)

Поскольку установленная ИС - одна, для опытного и для контрольного образцов отношение S_изм/S_сф будет одинаково. Поэтому это отношение в правой части выражения (31) может быть сокращено. В результате останется только искомая величина оптической плотности:

(32)

Нужно заметить, что, поскольку S_изм/S_сф еще меньше единицы, чем в случаях, когда используется светорассеивающая пластинка, наличие ИС сильнее снижает чувствительность спектрофотометра, чем установка светорассеивающей пластинки. Однако возможность правильно и точно измерять величину оптической плотности светорассеивающих образцов вполне компенсирует этот недостаток.

Полуэмпирические методы обсчёта искаженных светорассеиванием спектров поглощения, позволяющие корректировать искажения

К несчастью, далеко не все доступные спектрофотометры снабжены устройствами, позволяющими правильно измерять величину оптической плотности и спектр поглощения светорассеивающих объектов. В современных спектральных приборах эти устройства обычно являются опциями, поэтому не всегда входят в заказ при покупке.

Если прибор с соответствующими устройствами недоступен, корректировать уже измеренный и заведомо искаженный светорассеиванием спектр поглощения можно с помощью полуэмпирических приемов, которые и будут описаны ниже.

Данные приемы могут применяться в условиях соблюдения следующих предпосылок (граничных условий):

1. Светорассеивание и истинное поглощение излучения есть независимые друг от друга процессы, поэтому измеряемая величина оптической плотности рассеивающего объекта (D_изм) есть просто сумма оптических плотностей, определяемых рассеиванием (D_рс) и истинным поглощением (D). Иными словами, выполняется соотношение:

2. Величина истинного поглощения в объекте не зависит от телесного угла светосбора  (угла, в пределах которого рассеянные в объекте кванты попадают на фотодетектор и регистрируются). Иными словами:

3. Светорассеивание в образце однократное и не оказывает значимого влияние на величину оптического пути (l) квантов в веществе образца.

4. Форма спектра рассеивания не зависит от телесного угла светосбора . Иными словами, при изменении  показатель степени при  в зависимости D_рс=f() не меняется.

При соблюдении вышеуказанных условий можно применить для коррекции искаженных светорассеиванием в объекте спектров поглощения следующие два приёма:

Метод 1

Экспериментально показано, что для не обладающих истинным поглощением света частиц выполняется следующая зависимость:

(33)

Величины  и n для данного типа рассеивающих свет частиц в данных условиях измерения D_рс являются постоянными (константами). В принципе n зависит от формы и размеров светорассеивающих частиц (величина n меняется в пределах от 1 до 4), а  - от телесного угла светосбора , концентрации частиц в образце и ряда других обстоятельств.

Прологарифмируем выражение (33).

(34)

Запишем правило аддитивности D_рс и D (условие 1 из приведенных выше):

Прологарифмируем и это выражение:

(35)

Дальше преобразовывать выражение (35) математически невозможно. Однако можно вспомнить, что нет таких хромофорных молекул, которые обладали бы истинным поглощением в бесконечно широкой спектральной области оптического излучения. У любого хромофора можно найти такой спектральный диапазон, кванты которого им не поглощаются. При таких величинах  величина D у объекта будет равна 0, а, следовательно:

Если полагать, что и для данного случая справедливо выражение (34), то можно написать:

(36)

Из всех этих рассуждений, таким образом, вытекает, что в областях спектра, где истинное поглощение у исследуемого хромофора отсутствует (т.е. его D=0) должна выполняться линейная зависимость между lgD_изм и lg.

В эксперименте можно построить эту зависимость там, где исследуемый хромофор образца света не поглощает (обычно это самая длинноволновая часть видимой области спектра). Примерный вид получаемых зависимостей представлен на рис. 13.

lg

lgD_изм

lg₀

lgD_х

lg_х

Рисунок 13. Вид зависимости lgD_изм от lg для рассеивающего свет объекта. Обратите внимание на то, что экспериментально получена только длинноволновая часть зависимости (на ней имеются маркеры значений) при тех длинах волн, где истинное поглощение у содержащегося в объекте хромофора отсутствует (в примере D=0 при >₀). Остальная часть зависимости (при <₀) построена путем экстраполяции. Пояснения в тесте.

Поскольку, исходя из уравнения (36), полученная зависимость должна быть линейной, ее можно легко экстраполировать и в тот спектральный диапазон, где у объекта имеется истинное поглощение (рис. 13). Далее, при необходимости определения истинного поглощения при длине волны тестирующего излучения _х по полученной зависимости определяется величина соответствующего lg_х lgD_х, а по нему - собственно D_х. Полученная величина есть ни что иное, как D_рс при _х. После определения D_рс, истинную оптическую плотность D можно рассчитать, исходя из условия аддитивности:

Повторяя процедуру для всех длин волн тестирующего излучения интересующего нас спектрального диапазона, можно построить выправленный спектр поглощения D=f() светорассеивающего объекта.

Следует отметить, что данный метод может дать ошибку при определении величины D в области интенсивных полос поглощения исследуемого хромофора. Дело в том, что, при экстраполяции зависимости (36) из спектральной области, где поглощение отсутствует, в область истинного поглощения, автоматически предполагается, что эта зависимость справедлива и для поглощающих свет частиц. Однако, это не так. В области интенсивных полос поглощения характер изменения коэффициента преломления света при изменении длины волны тестирующего излучения не такой, как в отсутствие истинного поглощения (наблюдается так называемая аномальная дисперсия). Поэтому выражение (33) и его модификация – выражение (36) – утрачивают в этих спектральных зонах свою справедливость. Кроме того, в области интенсивных полос поглощения нарушается независимость процессов рассеивания и поглощения света, из-за чего правило аддитивности оптических плотностей объекта, связанных с этими двумя явлениями, также не работает. Впрочем, если точное определение абсолютных величин D не требуется, рассматриваемый метод коррекции спектров поглощения на внесенные светорассеиванием искажения вполне применим.

Метод 2

Второй прием, используемый для коррекции искаженных светорассеиванием спектров поглощения, более трудоёмок, но дает более точные результаты. В его основу положен тот факт, что величина D (истинной оптической плотности объекта), в отличие от величины D_рс, не зависит от телесного угла светосбора . Поэтому, измерив два спектра поглощения рассеивающего свет объекта при разных значениях этого угла (₁ и ₂), можно написать следующие выражения:

(37)

(38)

где D_изм(₁) и D_рс(₁) – значения измеряемой оптической плотности и оптической плотности, связанной со светорассеиванием, полученные при телесном угле светосбора ₁, а D_изм(₂) и D_рс(₂) – значения этих же показателей, полученные при телесном угле светосбора ₂. Величина же D от  не зависит и одинакова в обоих выражениях.

Вычтем из уравнения (37) уравнение (38):

(39)

В уравнении (37) перенесем величину D в левую часть выражения:

(40)

Разделим выражение (40) на выражение (39):

(41)

В полученном выражении (41) проанализируем правую часть. Поскольку ранее в качестве граничного условия применимости рассматриваемых методик указывалось, что «форма спектра рассеивания не зависит от телесного угла светосбора » (условие 4), очевидно, что правая часть выражения (41) не должна зависеть от длины волны тестирующего излучения . Обозначим ее, как К, и подставим в выражение (41) это обозначение:

(42)

Теперь выразим D в явном виде, исходя из уравнения (42):

(43)

В выражении (43) присутствуют только определяемые в эксперименте величины D_изм и параметр К. Чтобы произвести расчет D по этой формуле, требуется определить значение параметра К. Это достаточно просто сделать, вспомнив, что не существует хромофоров, которые поглощали бы излучение в бесконечно широком диапазоне . Поэтому всегда можно найти такие длины волны тестирующего излучения, при которой находящийся в объекте хромофор света не поглощает. При измерениях оптической плотности образца в данном спектральном диапазоне D_изм=D_рс. Поэтому, определив величину оптической плотности объекта при тех , где истинное поглощение отсутствует, можно рассчитать К по формуле ,заменив в ней величины D_рс на соответствующие значения D_изм. Поскольку величина К не зависит от длины волны тестирующего излучения , значение этого показателя во всех областях спектра поглощения будет одинаковым. Зная К, можно рассчитать величину D на всех длинах волн диапазона измерения, получив, таким образом, выправленный спектр поглощения исследуемого образца.

Анализ величины светорассеивания как метод изучения биологических объектов

При исследовании процессов, протекающих в биологических объектах, часто возникают ситуации, при которых истинное поглощение света в объекте не изменяется, тогда как его способность рассеивать оптическое излучение изменяется весьма значительно. Примерами подобного рода ситуаций могут служить агрегация клеток, изменение их формы и размера, или их лизис. В ходе указанных процессов изменения количества хромофоров в объекте, как правило, не происходит. Соответственно, способность объекта поглощать оптическое излучение не меняется. Однако все эти процессы сопровождаются изменением количества и формы оптических неоднородностей (т.е. рассеивающих центров) в объекте и, следовательно, изменением в его способности рассеивать свет. Для исследования характеристик таких процессов удобно специально оценивать величину светорассеивания в них. Для измерения выраженности светорассеивания применяются 2 принципиально различающихся приёма, турбодиметрия и нефелометрия (рис. 1).

При турбодиметрии схема измерения световых потоков, выходящих из объекта, принципиально такая же, как и при обычной фотометрии (рис. 14А): определяется величина потока излучения, выходящего из объекта без светорассеивания (т.е. не рассеянного или прямо проходящего излучения). Ясно, что при такой схеме измерения измеряемый световой поток будет тем меньше, чем сильнее светорассеивание в объекте. Для повышения чувствительности измерений в приборах, которые предназначены для турбодиметрии (турбодиметрах), как правило, специально ограничивается телесный угол светосбора фотодетектора. Достигается это за счет расположения кюветы с образцом далеко от этого детектора и с помощью установки специальной диафрагмы, ограничивающей выходную (а иногда – и входную) апертуру кюветного отделения (рис. 14А). Поскольку в областях спектра, где исследуемый объект способен еще и поглощать излучение, зависимость между поглощением света и его рассеиванием носит сложный характер, то для упрощения оценки результатов при измерениях светорассеивания чаще всего применяется излучение, кванты которого объектом заведомо не поглощаются. Для биологических объектов это красное видимое и ближнее инфракрасное излучение (650-900 нм). В таких условиях все регистрируемое ослабление проходящего прямо (не рассеянного) излучения будет определяться только собственно рассеиванием.

Нефелометрия (рис. 14Б) основана на анализе потоков рассеянного излучения, выходящих из объекта. Для того, чтобы сделать это, фотодетектор в нефелометрах (приборах, предназначенных для нефелометрии) располагается таким образом, чтобы не рассеянное излучение на него не попадало, т.е. под некоторым углом  к направлению освещения объекта (рис. 14Б). Во многих нефелометрах предусмотрена возможность изменения угла . В результате можно получать зависимость интенсивности рассеянного излучения (J_pc) от . Зависимость J_pc=f() носит название индикатрисса рассеивания. Из ее анализа можно получить много полезной информации об ориентации, форме и некоторых других свойствах рассеивающих центров (в клеточных суспензиях ими являются собственно клетки). При =0^о нефелометрия трансформируется в турбодиметрию. Поскольку при нефелометрии измеряется поток рассеянного излучения, измеряемая величина нарастает по мере усиления рассеивания света в объекте.

J_пп

Рисунок 14. Турбодиметрическая (А) и нефелометрическая (Б) схемы измерения величины светорассеивания в биологических объектах. J_o – падающее излучение; J_pc – рассеянная компонента выходящего излучения; J_пп – не рассеянная (прямо проходящая) компонента выходящего излучения;  - угол между направлением освещения объекта и направлением регистрации выходящего излучения; ФД - фодетектор; К – кювета с образцом; Д – диафрагма, ограничивающая поперечное сечение измеряемого пучка излучения.

Поскольку турбодиметрические измерения технически проще, чем нефелометрические, а получаемой с их помощью информации часто оказывается достаточно для оценки исследуемого процесса, турбодиметрия распространена шире, чем нефелометрия.

При турбодиметрическом анализе светорассеивания тех типов, которые наблюдаются в клеточных суспензиях, в определенном интервале концентраций рассеивающих центров (т.е. клеток) выполняется закон Бугера-Ламбера-Бера:

,

где:

• J_пп – интенсивность (или поток) не рассеянного (проходящего прямо) излучения;

• J_o – интенсивность (или поток) падающего излучения

• К – константа, величина которой зависит от условий измерения и свойств объекта (см. ниже);

• С – концентрация рассеивающих центров (в клеточных суспензиях – обычно клеток или их агрегатов);

• l – длина оптического пути.

В приведенной формуле вместо молярного коэффициента поглощения применяется константа К. Нужно заметить, что К будет константой только для данного конкретного турбидиметра в данных конкретных условиях измерения, т.к. величина этого показателя зависит от телесного угла светосбора , формы и размера рассеивающих центров, типа светорассеивания (при многократном рассеивании закон Бугера-Ламберта-Бера перестает выполняться) и многих других параметров. Величину К для данного, конкретного, типа объекта, и данного, конкретного турбидиметра, определяют экспериментально. К другим объектам, анализируемым на этом же приборе, и даже к самому исследованному объекту при его измерениях его светорассеивания на других турбидиметрах, измеренная величина К уже неприменима.

Турбодиметрический принцип измерения светорассеивания используется в большинстве оптических агрегометров, предназначенных для анализа агрегации клеток (например, тромбоцитов) и активно используемых в практической медицине. Методом тубодиметрии удобно также анализировать ряд процессов, сопровождающихся лизисом клеток или выходом из них цитоплазматического содержимого в среду инкубации, например, исследовать гемолиз.

В заключение этой главы необходимо также упомянуть об еще одном типе светорассеивания, которое наблюдается в биологических объектах. Это так называемое комбинационное или рамановское рассеивание. Принято считать, что при светорассеивании не происходит изменения энергии квантов, поэтому рассеянное излучение имеет те же спектральные характеристики, что и падающее. На самом деле в ходе взаимодействия с молекулами образца, которые находятся в состоянии теплового движения (обладают колебательной и вращательной компонентами внутренней энергии) у части квантов рассеянного света энергия изменяется. Величина этого изменения намного меньше, чем в случаях индукции ими электронных переходов между орбиталями, но вполне измерима при освещении объекта строго монохроматическим источником света (например, лазером). Для определения величины такого рассеивания анализируется спектральный состав рассеянного излучения. Если падающее на образец излучение было монохроматичным, на этом спектре комбинационного рассеивания можно увидеть расположенные симметрично относительно длины волны падающего на объект света, но смещенные в длинно- и коротковолновую стороны максимумы, так называемые «красные» и «синие» спутники.

Квантово-механические причины появления этих спутников состоят в том, что при соударении с молекулой рассеиваемый квант может либо приобрести часть ее тепловой энергии (молекула в результате ее потеряет), либо, напротив, часть ее потерять (молекула в результате ее приобретает). Электронные межорбитальные переходы при этом не наблюдаются, но меняются колебательные и вращательный компоненты внутренней энергии молекулы.

Спектры комбинационного рассеивания активно применяются для исследования, например, вторичной структуры белковых молекул, поскольку части таких молекул, находящиеся в форме -спирали, дают максимум на таком спектре, отличающийся от максимума, связанного с доменами в форме -складчатой структуры.

2.5.1. Эффект «сита» как пример неоднородного распределения хромофоров в биологических объектах.

Эффект «сита» (или эффект проскока, как его иногда называют) заключается в существенном занижении измеряемой оптической плотности у клеточных суспензий при небольшой концентрации клеток, если весь хромофор находится в клетках, а межклеточная среда света не поглощает. Он особенно выражен в интенсивных максимумах поглощения. Естественно, поскольку клеточные суспензии обладают еще и светорассеиванием, измерения должны проводиться в таких условиях, когда это явление значимого влияния на величину D_изм не оказывает. Возникает этот эффект в результате того, что при небольшом количестве клеток в суспензии они не в состоянии перекрыть всю освещаемую площадь объекта, и между ними остаются промежутки, через которые излучение проходит без ослабления. Для количественного описания эффекта «сита» введем следующие обозначения:

• J_o – интенсивность падающего на образец излучения;

• J_ч, Т_ч и D_ч – соответственно, интенсивность излучения, выходящего из клетки, светопропускание единичной клетки и ее оптическая плотность на длине волны измерения;

• J_с, Т_с и D_с – величины тех же показателей для клеточной суспензии в целом, измеряемые в эксперименте;

• J, Т и D – аналогичные показатели однородного раствора содержащегося в клетках хромофора при том же его количестве в образце;

• S – освещенная площадь образца;

• L – суммарная площадь поперечного сечения всех клеток, попавших в площадь S (затеняемая клетками площадь);

• =L/S – доля освещенной площади S, затеняемая клетками.

Выходящий из суспензии световой поток Ф_с= J_сS будет складываться из потока излучения, прошедшего через клетки (Ф_к= J_чL) и потока излучения, прошедшего мимо них (J_o(S-L)). Т.е. можно записать:

(44)

Разделив обе части выражения (44) на падающий поток J_oS, определим Т_с:

(45)

Теперь перейдём от пропускания к оптической плотности:

(46)

Для сопоставления оптической плотности раствора хромофора D с оптической плотностью суспензии D_с вспомним, что из условия эквивалентности раствора суспензии по количеству хромофора вытекает, что:

Поэтому можно записать, что:

(47)

Из уравнения (47) видно, что при =1 D_с становится равным D. Если же <<1, можно разложить правую часть выражения (47) в ряд Тейлора по степеням , ограничиваясь двумя членами разложения:

(48)

Поскольку D_ч – оптическая плотность единичной клетки, можно предположить, что она также мала и разложить в ряд Тейлора числитель в правой части выражения (48) по степеням D_ч. Первую скобку числителя раскладываем до второго члена, а вторую – только до первого. После сокращений получим:

(49)

Проанализируем выражение (49). Из него вытекает, что различия между D_с и D возрастают при увеличении D_ч и снижении . Поскольку D_ч определяется тем же, хромофором, что и D, в максимумах его поглощения разница между D_с и D будет велика, а минимумах – относительно мала. Кроме того, чем ниже будет концентрация клеток в суспензии (чем меньше ), тем сильнее будет сказываться эффект «сита» при спектрофотометрии.

Иногда, впрочем, специально анализируется величина эффекта «сита» в клеточных суспензиях. Её измерение позволяет вычислить такие важные показатели клеток, как их размер и концентрацию, а также количество хромофора в клетке.

Из выражения (49), в частности, следует, что:

Можно измерить D при двух длинах волн тестирующего излучения, ₁ и ₂. Тогда получим систему уравнений:

(50)

Индексы ₁ и ₂ указывают на значения соответствующей оптической плотности при длине волны тестирующего излучения ₁ и ₂. Поскольку хромофор в растворе и в клеточной суспензии один и тот же, и его концентрация одинакова в обоих образцах, можно записать следующее соотношение:

,

где и - значения молекулярных коэффициентов поглощения хромофора при длине волны тестирующего излучения ₁ и ₂. Обозначим величину как А, и введем это обозначение в систему (50):

(51)

Система уравнений (51) содержит только 2 неизвестных величины -  и -и, следовательно, имеет однозначное решение. Вспомним, что =L/S, а L может быть выражена, как L=S_чN, где S_ч – площадь поперечного сечения единичной клетки, а N – количество клеток в освещенном объеме образца (V_изм=Sl). Зная S и N, можно определить S_ч. Если же известны S_ч и D_ч, можно рассчитать количество (массу) хромофора в единичной клетке:

(51)

В уравнении (51) m – масса хромофора в единичной клетке, выраженная в молях,  - молярный коэффициент поглощения этого хромофора на длине волны измерения D_ч, V – объем клетки в л, S_ч – площадь ее поперечного сечения в дм²; l – оптический путь, который в данном случае принимается равным толщине клетки в направлении прохождения света, выраженный в дм.