3.4. Методы регистрации фотолюминесценции. Спектрофлуориметры. Особенности флуориметрии биологических объектов.

Хотя фотолюминесценция бывает двух типов (флуоресценция и фосфоресценция), приборы, применяемые для ее регистрации, называются флуориметрами. Если же прибор позволяет регистрировать еще и спектральные характеристики фотолюминесценции, то это спектрофлуориметр.

Отсутствие упоминания о регистрации фосфоресценции в названиях приборов связано, скорее всего, с тем, что в жидких объектах (растворах) этот вид вторичного свечения при комнатной температуре практически не наблюдается – из-за большого времени пребывания электронов на орбитали Т вероятность излучательного перехода ТS₀ оказывается мала (см. выше). Для регистрации фосфоресценции требуется, чтобы подвижность люминесцирующих молекул в объекте была ограничена. Этого можно достичь либо путем охлаждения образца до низких температур (например, до 77^оК), либо путем применения растворителей с очень высокой вязкостью. Имеется, впрочем, ряд специфических биологических объектов, в которых фосфоресценцию можно регистрировать и при комнатной температуре. К таковым, например, относится ткань хрусталика глаза.

Простейшие флуориметры не содержат в своей оптической схеме монохроматоров. Выделение нужных спектральных участков излучения в таких приборах осуществляется с помощью сменных светофильтров (рис. 17.)

Рисунок 17. Схема регистрации фотолюминесценции на флуориметре со сменными светофильтрами. К- кювета с образцом; 1 –светофильтр для выделения возбуждающего света (J₀) и его спектр пропускания; 2 – светофильтр для выделения фотолюминесценции (J_фл) и его спектр пропускания; (1+2) – суммарный спектр пропускания светофильтров 1 и 2.

Публикуется с модификациями по: Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: «Дрофа», 2006, с. 42.

Такой вариант флуориметров отличается достаточно высокой чувствительностью, простотой и дешивизной. Однако эти приборы не позволяют регистрировать спектральные характеристики вторичного свечения и, следовательно, их нельзя использовать при решении качественных задач.

Применение флуориметров со сменными светофильтрами требует правильного подбора тех светофильтров, которые будут применяться в каждом конкретном случае. Светофильтр для выделения возбуждающего света должен пропускать только то излучение, которое поглощается исследуемым люминофором, но не должен пропускать излучение источника в области, где данный люминофор люминесцирует. Светофильтр же для выделения фотолюминесценции должен пропускать только кванты этой люминесценции, но обязан полностью задерживать весь возбуждающий свет. Сложенные вместе, эти два светофильтра, как правило, света в зоне проведения измерений вообще не пропускают (рис. 17).

Спектрофлуориметры (рис. 18) содержат в своей схеме 2 монохроматора (один располагается между источником излучения и объектом, второй – между объектом и фотодетектором). Эти приборы позволяют полностью использовать преимущества люминесцентного анализа, поскольку на них можно регистрировать как спектры фотолюминесценции, так и спектры возбуждения фотолюминесценции.

Определение 17:

Спектром возбуждения фотолюминесценции называется зависимость интенсивности фотолюминесценции от длины волны (энергии квантов, частоты, волнового числа) возбуждающего излучения при постоянной интенсивности последнего.

Рисунок 18. Схема спектрофлуориметра. 1 – источник излучения; 2 –конденсорная линза; 3 и 5 – монохроматоры; 4 – кювета с образцом; 6 - фотодетектор (фотоэлектронный умножитель); 7 – блок питания фотодетектора; 8 - усилитель сигнала фотодетектора (усилитель постоянного тока с высоким входным сопротивлением); 9 – регистрирующее устройство (самописец или аналогово-цифровой преобразователь; в последнем случае сигнал фотодетектора регистрируется затем компьютером в цифровой форме). J₀ – возбуждающее излучение; J_л – люминесценция.

Публикуется с модификациями по: Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: «Дрофа», 2006, с. 43.

Существует 3 схемы регистрации люминесценции образцов, различающиеся по углу между направлением освещения объекта (направлением падения возбуждающего света) и направлением регистрации люминесценции (рис. 19).

J₀

J₀

J_фл

J₀

J_фл

J_фл

А.

Б.

В.

Рисунок 19. Схемы регистрации фотолюминесценции. J₀ – возбуждающее излучение; J_фл - фотолюминесценция. А – регистрация в проходящем свете; Б – регистрация под прямым углом; В – регистрация с передней стенки кюветы.

Следует заметить, что эти 3 схемы различаются по чувствительности к артефактам, мешающим проведению флуориметрических измерений. В частности, схема регистрации в проходящем свете (рис. 19, А) требует особой предосторожности: при ее использовании высока вероятность попадания на фотодетектор блуждающего света, содержащегося в попадающем на объект излучении. Кроме того, при такой схеме регистрации регистрируемая люминесценция особенно сильно меняется вследствие таких эффектов, как экранировка возбуждающего света, реабсорбция фотолюминесценции, светорассеивание (см. ниже). Видимо, поэтому данная схема в спектрофлуориметрах встречается весьма редко. В большинстве приборов этого типа, имеющихся в продаже, применена схема регистрации фотолюминесценции под прямым углом (рис. 19, Б). Эта схема позволяет ослабить влияние на результаты измерений собственной люминесценции кюветы и удобна при небольшой оптической плотности объекта. Однако и в этом случае регистрируемая люминесценция оказывается чувствительна к наличию в объекте светорассеивания и другим артефактам. Кроме того, с ростом концентрации люминесцирующих молекул из-за того, что при больших D они начинают возбуждаться только в тонком слое вблизи передней стенки кюветы, регистрируемый поток J_фл при измерении с использованием данной схемы начинает резко снижаться (на зависимости J_фл=f(c) наблюдается «загиб» вниз). Поскольку биологические образцы обычно отличаются достаточно высокой концентрацией вещества и часто сильно рассеивают свет, при их флуориметрическом исследовании удобнее всего применять схему регистрации люминесценции с передней стенки кюветы (рис. 19, В). При такой схеме регистрации, если концентрация люминофоров достаточно высока, кванты возбуждающего света глубоко в объект не проникают. Соответственно, регистрируется люминесценция тонкого слоя образца, прилегающего к его передней поверхности. Из-за небольшого расстояния, которое при данной схеме измерения кванты возбуждающего света и кванты фотолюминесценции проходят в веществе объекта, влияние большинства артефактов, изменяющих регистрируемое свечение, оказывается достаточно мало.

Рассмотрим теперь те артефакты, которые мешают измерению фотолюминесценции.

Возможные причины искажений величины регистрируемой фотолюминесценции

Паразитный свет. При регистрации фотолюминесценции предполагается, что ее возбуждение осуществляется либо монохроматическим излучением, либо излучением в достаточно узком спектральном диапазоне. Вместе с тем, как уже указывалось выше, в составе выходящего из любого монохроматора света имеется немонохроматическая примесь - паразитное излучение. Поскольку этот свет – немонохроматический, часть его квантов будет иметь те же длины волн, что и кванты фотолюминесценции. Если эти кванты попадут на фотодетектор флуориметра, результаты измерений интенсивности фотолюминесценции окажутся завышены. Этот эффект особенно силен в светорассеивающих объектах, а также при применении метода регистрации фотолюминесценции по схеме в проходящем свете (рис. 19, А).

Кроме того, паразитное излучение может содержать кванты, которые вызывают фотолюминесценцию кюветы, растворителя и других потенциально способных к фотолюминесценции компонент исследуемого объекта. Если максимумы в спектрах фотолюминесценции у этих компонент объекта близки к таковым у исследуемого вещества, регистрируемая фотолюминесценция может быть дополнительно завышена.

Для учета влияния примеси паразитного излучения следует обязательно измерять величину регистрируемой интенсивности свечения объекта, разместив на пути возбуждающего света (перед кюветой с объектом) светофильтр, который может пропускать кванты фотолюминесценции, но не пропускает кванты возбуждающего излучения в используемом спектральном диапазоне. Регистрируемый сигнал при таком измерении будет состоять из паразитного излучения и фотолюминесценции, связанной с другими веществами, присутствующими в объекте и возбуждаемыми паразитным излучением. Его величину следует затем вычесть из измеренной в обычном режиме интенсивности фотолюминесценции образца.

Комбинационное рассеивание на молекулах воды. Для возбуждения фотолюминесценции большинства соединений в биологических образцах применяется излучение ультрафиолетового спектрального диапазона. Однако это излучение обладает способностью к комбинационному (рамановскому) светорассеиванию на молекулах воды, всегда имеющихся в биологическом объекте. При комбинационном рассеивании явления у части рассеянных квантов изменяется длина волны. В результате в спектре рассеянного света появляются так называемые «синие» и «красные» спутники, т.е. максимумы, смещенные относительно длины волны исходного излучения соответственно в коротко- и длинноволновую сторону (см. выше). К несчастью, у воды имеется такой максимум («красный» спутник), смещенный в длинноволновую сторону примерно на 2050 нм, и часто попадающий в область регистрации фотолюминесценции. Если не сделать соответствующей поправки, часть этих рассеянных квантов может быть зарегистрирована, что приведет к завышению результатов измерений фотолюминесценции образца. Для устранения возможного влияния комбинационного рассеивания возбуждающего излучения на молекулах воды при измерении фотолюминесценции следует вычитать из полученных результатов измерения результаты анализа фотолюминесценции кюветы с чистой средой инкубации (растворителем) образца. Следует, впрочем, иметь в виду, что в чистом растворителе величина сигнала комбинационного рассеивания обычно несколько больше, чем в объекте, поскольку в последнем случае часть квантов возбуждающего света поглощается, а не рассеивается.

Экранирование возбуждающего света. Выше, в разделе, посвященном спектрофотометрии, уже указывалось, что в биологических объектах обычно содержится много типов хромофорных молекул, максимумы в спектрах поглощения которых могут накладываться друг на друга. Из-за этого при флуориметрическом анализе трудно бывает подобрать такую длину волны возбуждающего света, при которой поглощал бы свет и возбуждался только один люминофор. Обычно поглощает возбуждающее излучение не только исследуемое вещество, но и другие хромофоры объекта. Как следствие, доля возбуждающего света, попадающего на молекулы исследуемого соединения, т.е реальная величина J₀ для него, оказывается занижена. Соответственно, снижается (в сравнении с раствором чистого люминофора данного типа) и величина J_фл. Это явление носит название экранирование возбуждающего света или эффект экранировки. При использовании затем для определения концентрации исследуемого вещества калибровочной зависимости J_фл=f(c), полученной по образцам с растворами чистого люминофора, результат оказывается занижен.

Для расчёта поправочного коэффициента на эффект экранировки рассмотрим следующую модель: пусть имеется плоскопараллельный объект толщиной l на который строго нормально к поверхности падает параллельный пучок монохроматического излучения с интенсивностью J₀. На расстоянии х от передней стенки объекта выберем слой толщиной dx, достаточно тонкий для того, чтобы эффектом экранировки в нем можно было пренебречь. В соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера интенсивность света J^, попадающая на слой dx, будет составлять:

(58)

В выражении (58)  - величина молярного коэффициента поглощения на длине волны возбуждения у исследуемого вещества; с – концентрация этого вещества в образце; _i и с_i – соответственно молярный коэффициент поглощения и концентрация i-го экранирующего соединения.

Запишем теперь, насколько ослабиться J^ после прохождения слоя dx. Поскольку толщина этого слоя мала, это ослабление (dJ^) составит:

(59)

Общее же ослабление возбуждающего света за счет поглощения исследуемым веществом (J ) составит:

(60)

В полученном выражении (60) D_об и D – соответственно, общая оптическая плотность образца и оптическая плотность исследуемого вещества на длине волны возбуждающего света.

С учетом того, что интенсивность фотолюминесценции J_фл в любом случае есть

мы можем написать, что поправочный коэффициент _э на величину экранирующего эффекта будет равен:

(61)

В выражении (61) J_фл – интенсивность фотолюминесценции исследуемого люминофора в отсутствие экранирования возбуждающего света; J^_фл - эта интенсивность в условиях экранирования; D_об и D – соответственно, общая оптическая плотность образца и оптическая плотность исследуемого вещества на длине волны возбуждающего света. Измерив J^_фл можно, таким образом, рассчитать J_фл, умножив J^_фл на _э.

Из выражения (61) вытекает, что в разбавленных объектах (при D_об<0,1) влияние экранирования возбуждающего света на регистрируемую J_фл будет невелико (в этом случае _э1). Это позволяет использовать разведение образца как один из способов снижения влияния эффекта экранировки на регистрируемую фотолюминесценцию конкретного соединения.

Реабсорбция фотолюминесценции.

Очевидно, что, перед тем, как выйти из кюветы, каждый квант фотолюминесценции проходит некоторое (большее или меньшее) расстояние внутри объекта. Если же в объекте имеются хромофоры, способные поглощать кванты фотолюминесценции, то часть этих квантов будет поглощена. В результате количество квантов фотолюминесценции, попадающее на фотодетектор и регистрируемое им, снижается. Как следствие, величина J_фл оказывается заниженной, и флуориметрический анализ дает неверные результаты. Описанное событие носит название реабсорбции фотолюминесценции.

Следует заметить, что, в отличие от эффекта экранировки, который всегда связан с присутствием в образце посторонних хромофорных молекул, реабсорбция может наблюдаться и в образце, содержащем только одно соединение. Связано это с тем, что у многих веществ-люминофоров спектр возбуждения фотолюминесценции (близкий по форме к спектру поглощения, см. ниже) и спектр фотолюминесценции перекрываются друг с другом (длинноволновая часть спектра возбуждения фотолюминесценции накладывается на коротковолновый участок спектра фотолюминесценции). Этот вид реабсорбции носит название собственная реабсорбция. В качестве поглощающих кванты фотолюминесценции хромофоров в данном случае выступают сами люминесцирующие молекулы. Другой вид реабсорбции – поглощение квантов фотолюминесценции посторонними соединениями, присутствующими в объекте. Этот вариант носит название примесная реабсорбция.

Заметим, что реабсорбция, как явление, сильнее искажает результаты флуориметрии, чем экранирование возбуждающего света. Если при наличии эффекта экранировки вид спектра фотолюминесценции не меняется (а, следовательно, остаётся возможным решение качественной задачи), то реабсорбция существенно искажает вид регистрируемого спектра флуоресценции. В качестве примера рассмотрим влияние собственной реабсорбции (рис. 20).

₀

Рисунок 20. Искажение спектра фотолюминесценции при наличии собственной реабсорбции. D – оптическая плотность; J_фл – интенсивность фотолюминесценции; ₀ – длинноволновая граница области поглощения; 1 – спектр поглощения; 2 – истинный спектр фотолюминесценции; 3 – регистрируемый спектр фотолюминесценции. Заштрихован участок спектра фотолюминесценции, подверженный собственной реабсорбции. Пояснения в тесте.

Публикуется с модификациями по: Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: «Дрофа», 2006, с. 55.

На рис. 20 представлены спектр поглощения (кривая 1) и спектр фотолюминесценции (кривая 2) некоторого соединения. Видно, что длинноволновая граница области поглощения данного соединения (₀) расположена в пределах зоны фотолюминесценции. Это приводит к появлению собственной реабсорбции части квантов фотолюминесценции его молекулами. Если наличие собственной реабсорбции не будет учтено, коротковолновое плечо спектра фотолюминесценции окажется «урезано», и спектрофлуориметр зарегистрирует спектр фотолюминесценции, соответствующий кривой 3. Если же ₀ расположена в более длинноволновой области, чем _max в спектре фотолюминесценции, т.е. реабсорбируются даже кванты вторичного свечения с длиной волны _max, может наблюдаться кажущееся (регистрируемое) смещение максимума спектра фотолюминесценции в длинноволновую сторону. Обратите внимание на то, что длинноволновое плечо спектра фотолюминесценции в результате собственной реабсорбции не страдает. Поэтому, если необходимо решение только количественной задачи, для исключения влияния рассматриваемого явления на результат достаточно анализировать зависимость J_фл=f(c) в том спектральном участке фотолюминесценции, где кванты вторичного свечения не реабсорбируются.

В случаях, когда в объекте наблюдается примесная реабсорбция, вид искажения спектра фотолюминесценции определяется видом спектра поглощения реабсорбирующих ее кванты примесей. Поэтому для внесения соответствующих поправок перед измерением спектра фотолюминесценции следует измерить спектр поглощения объекта в той спектральной области, где люминесцирует изучаемое соединение.

Если же необходима регистрация истинного спектра фотолюминесценции, нужно либо принять меры к исключению влияния реабсорбции на этот спектр, либо корректировать уже измеренный спектр свечения с помощью внесения соответствующих поправок.

Из приведенных выше (рис. 19) схем измерения фотолюминесценции наименее чувствительна к искажениям, вносимым реабсорбцией, схема с регистрацией свечения с передней стенки кюветы (рис. 19, В). Недостатком этой схемы является необходимость применения исследуемых веществ в достаточно высоких концентрациях. Но, если это условие выполнено, как уже указывалось выше, при такой схеме будут регистрироваться кванты фотолюминесценции, излученные в тонком слое исследуемого объекта, прилегающем к передней стенке кюветы. Путь, проходимый квантами фотолюминесценции в веществе объекта, оказывается мал, и вероятность их поглощения падает.

Рассмотрим теперь, как можно корректировать уже искаженный реабсорбцией спектр фотолюминесценции. Для этого применяется подход, в принципе аналогичный тому, который применяется при коррекции искажений вследствие экранирования возбуждающего света. Анализируется модель, уже описанная выше, в разделе, посвященном эффекту экранировки. Для такой модели регистрируемая интенсивность фотолюминесценции объема объекта толщиной dx, в условиях, когда реабсорбцией можно было пренебречь, может быть записана в виде:

(62)

Если же часть квантов фотолюминесценции реабсорбируется (оптический путь квантов фотолюминесценции мы принимаем равным оптическому пути квантов возбуждающего света) регистрируемое излучение этого объема окажется ослабленным:

(63)

В выражении (63) _i и с_i – соответственно молярный коэффициент поглощения и концентрация i-го реабсорбирующего кванты фотолюминесценции компонента объекта.

Со всего образца в условиях реабсорбции будет, таким образом, регистрироваться J^_фл следующей величины:

(64)

В уравнении (64) D и D_Р – соответственно оптическая плотность исследуемого вещества (на длине волны возбуждения) и суммарная оптическая плотность всех реабсорбирующих фотолюминесценцию соединений в образце (в области фотолюминесценции).

С учетом того, что в отсутствие реабсорбции должны регистрироваться суммарная интенсивность фотолюминесценции объекта J_фл=kqJ₀(1-10^-D), можно рассчитать поправочный коэффициент на эффект реабсорбции фотолюминесценции (_Р):

(65)

Тушение фотолюминесценции.

В ряде случаев в сложных по химическому составу объектах фотолюминесценция оказывается ослабленной (иногда – и совсем не регистрируется) из-за наличия в их составе соединений-тушителей фотолюминесценции. Такие соединения эффективно перехватывают энергию у возбужденных молекул-люминофоров (в ходе соударений или при образовании комплексов), но сами способностью к фотолюминесценции не обладают. В результате оказывается сниженным реальный квантовый выход (q) люминесцирующих веществ, и J_фл снижается.

Сильными тушителями фотолюминесценции являются кислород, ионы парамагнитных металлов, нитраты, галогениды и многие другие вещества, часто встречающиеся в биологических объектах. Поскольку явление тушения фотолюминесценции весьма распространено и используется специально для исследования структурных особенностей биологических объектов, ниже мы уделим ему внимание отдельно.

Влияние светорассеивания на фотолюминесценцию.

Влияние рассеивания света в объекте на величину регистрируемой J_фл носит достаточно сложный характер и зависит от типа светорассеивания и применяемой схемы регистрации фотолюминесценции.

Ранее уже упоминалось о комбинационном светорассеивании на молекулах воды, из-за которого возникает «красный» спутник в возбуждающем свете, приводящий к завышению результатов флуориметрических измерений.

Завышение J_фл также возможно при наличии в образце многократного светорассеивания, сопровождающегося увеличением оптического пути для квантов возбуждающего света, и ростом из-за этого вероятности их поглощения.

Впрочем, в мутных образцах рассеивается не только возбуждающее излучение, но и фотолюминесценция. Если применяются схемы регистрации фотолюминесценции в проходящем свете или под прямым углом (схемы А и Б, рис. 19), расстояние, проходимое квантами фотолюминесценции в веществе образца, достаточно велико, и вероятность их рассеивания также велика. Поэтому при использовании таких схем измерения величина J_фл в мутных объектах, как правило, оказывается снижена в сравнении с немутными. С другой стороны, если фотолюминесценция регистрируется с передней стенки кюветы (схема В, рис. 19), из-за рассеивания часть квантов фотолюминесценции, которые распространялись вглубь кюветы, могут быть перенаправлены в сторону фотодетектора и зарегистрированы. Поэтому при данной схеме регистрации J_фл результаты флуориметрии могут при наличии светорассеивания оказаться завышенными.

Влияние на фотолюминесценцию неоднородного распределения молекул-люминофоров в объекте.

Поскольку неоднородное распределение молекул-хромофоров в объекте приводит к снижению его реальной оптической плотности, J_фл в таких объектах оказывается сниженной. Иными словами, при равном содержании молекул-люминофоров идеально однородный их раствор будет люминесцировать сильнее, чем объект, в котором эти молекулы неоднородно распределены по объёму. В какой-то степени можно ослабить этот эффект, если возбуждать люминесцирующие вещества излучением вне их интенсивных максимумов поглощения, где влияние неоднородности распределения соединений на оптическую плотность особенно велико.